一、靶向重測序技術(shù)概述

1.1 靶向重測序技術(shù)的定義和原理

在介紹靶向重測序之前，我們先了解一下全基因組測序(WGS)。全基因組測序（WGS, Whole Genome Sequencing）是下一代測序技術(shù)，用于快速，低成本地確定生物體的完整基因組序列。其目的是準(zhǔn)確檢測出每個樣本（這里特指人）基因組中的變異集合，也就是人與人之間存在差異的那些DNA序列。即是對生物體整個基因組序列進(jìn)行測序，可以獲得完整的基因組信息。

NGS技術(shù)正逐年成熟，這使得全基因組測序的成本越來越低，但是對全基因組進(jìn)行測序后得到的極其龐大、繁雜的數(shù)據(jù)量的分析工作并沒有隨之一起變得更加簡單。相反，測序技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)了兩個極端的方向：一種是大而全的全基因組測序，一種是小而精的靶向重測序。

相比于全基因組測序（WGS），靶向重測序即將一組基因或基因組區(qū)域分離出來并對其進(jìn)行測序。使用新一代測序（NGS）的靶向方法讓研究人員能夠?qū)�時間、費(fèi)用和數(shù)據(jù)分析集中在感興趣的特定區(qū)域。這種靶向分析包括外顯子組（基因組的蛋白質(zhì)編碼部分）、感興趣的特定基因、以及基因或線粒體DNA中的目標(biāo)。

靶向測序?qū)⒏信d趣的基因組區(qū)域通過捕獲試劑盒進(jìn)行富集后測序，利用較少的數(shù)據(jù)量就能得到超高的靈敏度和準(zhǔn)確度，實現(xiàn)變異位點的快速篩選。相較全基因組測序和全外顯子測序，靶向測序能夠聚焦所關(guān)注的區(qū)域，去除冗余數(shù)據(jù)的干擾，同時最大限度地利用測序reads，測序成本低且測序深度深，尤其適用于在臨床應(yīng)用中樣本量少時的選擇。

靶向測序的方法主要分為多重擴(kuò)增子測序和雜交捕獲測序兩條技術(shù)路線。多重擴(kuò)增子測序即針對感興趣的目標(biāo)區(qū)域，設(shè)計多重PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增富集并進(jìn)行測序的技術(shù)。通常適用于檢測幾十到幾千個位點，或幾十kb以下的區(qū)域。

1、設(shè)計多重 PCR 引物，從基因組 DNA 中擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域序列

2、優(yōu)化多重 PCR 反應(yīng)，使目標(biāo)區(qū)域能夠均勻覆蓋

3、擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，加測序接頭，不同樣本加上不同 index 區(qū)分

4、利用高通量測序平臺對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行深度測序

雜交捕獲測序，目前應(yīng)用的主要是液相雜交捕獲測序，即基于堿基互補(bǔ)配對原理，設(shè)計合成核酸探針，對DNA文庫進(jìn)行基于液相環(huán)境的目標(biāo)區(qū)域雜交富集，并進(jìn)行測序。液相雜交捕獲測序可適用于幾kb到上百M(fèi)b的基因組目標(biāo)區(qū)域的檢測，可檢測SNV，InDel，CNV，SV，基因融合等變異。

	液相雜交捕獲	擴(kuò)增子測序
富集策略	探針雜交	多重PCR
核酸片段長度	打斷為500bp左右	無要求
目標(biāo)區(qū)域總長	>100K	<1000K
檢測變異類型	SNP、大片段Indels、融合基因、擴(kuò)增等	SNP、小片段Indels、擴(kuò)增等
特異性	70%左右	95%以上
樣本起始量	200ng	10ng
操作時間	全程12h，手工操作4h	全程4h，手工操作5min
探針/引物花費(fèi)	多	少
樣本平均花費(fèi)	總樣本量>20，花費(fèi)較少總樣本量<20，花費(fèi)較多	較少
操作難度	較高	低
適用范圍	發(fā)現(xiàn)更多新的從未報道過的SNP、融合基因、大片段Indels等	發(fā)現(xiàn)更低頻（低于0.1%）的突變，適用于ctDNA的研究
制約因素	探針捕獲效率	Panel擴(kuò)增均一性

1.2 靶向重測序技術(shù)服務(wù)流程

二、靶向重測序技術(shù)在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 靶向重測序技術(shù)在單基因遺傳病研究中的應(yīng)用

單基因遺傳病是指由單個基因變異所導(dǎo)致的疾病，這些變異可能包括基因突變、基因拷貝數(shù)變異等。靶向重測序技術(shù)可以對與單基因遺傳病相關(guān)的基因或基因組區(qū)域進(jìn)行深度測序，從而檢測出可能導(dǎo)致疾病的變異。

例如，在囊性纖維化（Cystic Fibrosis）研究中，靶向重測序技術(shù)被用于檢測CFTR基因的變異。CFTR基因是一種編碼氯離子通道的基因，其變異可能導(dǎo)致囊性纖維化的發(fā)生。通過靶向重測序技術(shù)，可以快速檢測出CFTR基因的變異，為診斷和治療方法的選擇提供依據(jù)。

此外，靶向重測序技術(shù)還可以用于檢測基因多態(tài)性，即不同個體之間存在的基因變異。這些多態(tài)性可能對個體的表型特征產(chǎn)生影響，如對藥物的反應(yīng)、疾病易感性等。通過對這些多態(tài)性的檢測，可以為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供指導(dǎo)。

2.2 靶向重測序技術(shù)在復(fù)雜疾病研究中的應(yīng)用

復(fù)雜疾病是指由多基因和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的疾病，如糖尿病、心血管疾病、癌癥等。靶向重測序技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)篩選出與復(fù)雜疾病相關(guān)的變異位點，從而為復(fù)雜疾病的研究提供更深入的見解。

例如，在糖尿病的研究中，靶向重測序技術(shù)可以針對與胰島素分泌和敏感性相關(guān)的基因進(jìn)行深度測序，從而檢測出可能導(dǎo)致糖尿病的變異。通過對這些變異的檢測和分析，可以為糖尿病的診斷、治療和預(yù)防提供依據(jù)。

2.3 靶向重測序技術(shù)在癌癥基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

對癌癥組織基因測序，可以了解癌癥組織的基因變異情況，為癌癥的診斷和分類提供依據(jù)。例如，在肺癌研究中，靶向重測序技術(shù)可以針對與肺癌發(fā)生相關(guān)的基因或基因組區(qū)域進(jìn)行深度測序，從而檢測出可能導(dǎo)致肺癌的變異。通過對這些變異的檢測和分析，可以為肺癌的診斷、治療和預(yù)防提供依據(jù)。

三、靶向重測序技術(shù)的優(yōu)勢

3.1 高特異性：靶向重測序技術(shù)針對所關(guān)注的區(qū)域進(jìn)行測序，能夠去除冗余數(shù)據(jù)的干擾，最大限度地利用測序reads，從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)果。

3.2 高測序深度：靶向重測序技術(shù)可實現(xiàn)深度測序，能夠檢測出低頻變異，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。

3.3 高效經(jīng)濟(jì)：靶向重測序技術(shù)所需的樣本量較少，測序成本低，適用于在臨床應(yīng)用中樣本量少時的選擇。

3.4 高通量：靶向重測序技術(shù)可以同時對多個目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測序，提高了測序的效率。

四、總結(jié)

4.1 總結(jié)靶向重測序技術(shù)的價值和意義

靶向重測序技術(shù)是一種高效經(jīng)濟(jì)的基因測序方法，具有高特異性和測序深度，廣泛應(yīng)用于臨床實踐和基因組學(xué)研究。它可以幫助我們更好地理解疾病的病因、病理和病程，為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供依據(jù)，同時也可以發(fā)現(xiàn)新的基因變異和物種演化信息，為生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究提供更多的數(shù)據(jù)支持。

4.2 靶向重測序技術(shù)的發(fā)展方向和應(yīng)用前景

首先，靶向重測序技術(shù)的特異性、測序深度和覆蓋范圍等性能將得到進(jìn)一步提升。

其次，靶向重測序技術(shù)將更多地應(yīng)用于復(fù)雜疾病的研究中。目前，靶向重測序技術(shù)已經(jīng)在單基因遺傳病研究中得到了廣泛應(yīng)用，靶向重測序技術(shù)可以通過對全基因組的深度測序，篩選出與復(fù)雜疾病相關(guān)的變異位點，為復(fù)雜疾病的研究提供更深入的見解。

最后，靶向重測序技術(shù)可以與其它基因組學(xué)技術(shù)（如全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序等）相結(jié)合，形成更為綜合的解決方案，從而更好地解析生物過程的復(fù)雜性。