張磊、解源團隊揭示Wnt/Mfsd2a信號通路在膠質瘤藥物遞送中的分子機制
腦膠質瘤是成人最常見的顱內惡性腫瘤，具有高侵襲性和高復發(fā)率。藥物無法有效通過血腦屏障是導致治療效果不佳的重要原因之一。課題組前期應用單細胞測序技術對膠質母細胞瘤及其癌旁組織的血管內皮細胞進行單細胞轉錄組分析，經研究發(fā)現：腫瘤血管內皮細胞仍然保持一定程度的血腦屏障特性。大量活性外排轉運蛋白和緊密連接分子仍存在于腫瘤內皮細胞中，很可能會影響抗腫瘤藥物的有效遞送。
2023年1月2日，陜西師范大學生命科學學院張磊教授解源副教授團隊與第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院王樑教授團隊，共同通訊在《Neuro-Oncology》雜志上發(fā)表題為《Wnt Signaling Regulates MFSD2A-dependent Drug Delivery through Endothelial Transcytosis in Glioma》的研究論文。
本研究應用多種轉基因小鼠模型，揭示了Wnt/Mfsd2a信號通路調控血管內皮細胞胞吞轉運在膠質瘤藥物遞送中的分子機制，為膠質瘤的治療方案設計提供重要依據。
圖片來源：《Neuro-Oncology》
（https://doi.org/10.1093/neuonc/noac288）
研究材料
在這項研究中，研究人員應用了Cav1敲除（Cav1-ko）小鼠、Mfsd2a敲除（Mfsd2a-ko）小鼠、Cav1/Mfsd2a雙敲小鼠和可持續(xù)表達Mfsd2a的Mfsd2a-GOF（Cdh5-CreERT2; ROSA26STOPfloxMfsd2a/TdTomato）小鼠，構建了體內GBM模型（其中Cav1敲除小鼠，Mfsd2a敲除小鼠，Cdh5-CreERT2小鼠，Mfsd2a-ROSA26STOPfloxMfsd2a/TdTomato小鼠模型均由賽業(yè)生物提供）。體外研究中則采用了小鼠腦微血管內皮細胞bEND.3構建體外血腦屏障模型。
研究方法
此外，研究人員還在本研究中應用了多種技術，例如，利用單細胞測序技術、QPCR、體外BBB模型、生存實驗、高效液相色譜檢測、免疫電鏡技術、免疫熒光染色、免疫組織化學染色、western blot、小鼠內皮細胞轉錄組分析、GSEA等。
技術路線
研究結果
1. 阻斷Wnt信號通路可顯著增強化療藥物遞送
使用體外血腦屏障模型（圖1A），作者發(fā)現阻斷Wnt信號通路可顯著增強化療藥物替莫唑胺(TMZ)穿透血腦屏障的效率（圖1B）。同時，在兩種原位膠質母細胞瘤小鼠模型中，使用Wnt信號通路阻斷劑LGK974治療荷瘤小鼠，通過高效液相色譜測定顱內腫瘤中TMZ的含量，發(fā)現Wnt信號通路阻斷可顯著增強TMZ向腫瘤組織遞送（圖1C-D）。
阻斷Wnt信號通路可顯著增強藥物遞送[1]
2. Wnt信號通路阻斷能夠降低血腦屏障關鍵分子Mfsd2a的表達
通過對腫瘤血管細胞進行轉錄組測序分析發(fā)現，Wnt信號通路阻斷能夠降低血腦屏障關鍵分子Mfsd2a的表達，同時增加血管通透性標記物Plvap和細胞囊泡胞吞轉運標記物CAV1的表達（圖2）。
Wnt信號通路在腫瘤內皮細胞中調控轉胞吞作用相關基因[1]
隨后，作者應用Mfsd2a敲除（Mfsd2a-ko，由賽業(yè)生物提供）小鼠和可持續(xù)表達Mfsd2a的Mfsd2a-GOF（Cdh5-CreERT2；ROSA26STOPfloxMfsd2a/TdTomato，由賽業(yè)生物提供）小鼠進一步驗證分析，發(fā)現Wnt信號通路調控化療藥物遞送依賴Mfsd2a的表達。圖3A可見在Mfsd2a-GOF小鼠中未觀察到Wnt信號通路抑制所導致的TMZ遞送增強。在Mfsd2a-GOF小鼠中，LGK974和TMZ治療聯(lián)合治療的生存獲益被逆轉（圖3B）。以上結果表明，Wnt介導的TMZ遞送調節(jié)依賴于Mfsd2a的表達。
Wnt信號通路調控化療藥物遞送依賴Mfsd2a的表達[1]
3.Wnt信號通路影響Mfsd2a介導的胞吞作用
作者應用體外血腦屏障模型、Cav1敲除（Cav1-ko）小鼠、Cav1/Mfsd2a雙敲小鼠進一步進行驗證，發(fā)現降低caveolae介導的細胞胞吞轉運后可影響Mfsd2a敲除對化療藥物遞送的調控作用。在Mfsd2a敲除小鼠中TMZ遞送顯著增強，但在Mfsd2a和Cav1雙敲小鼠中，增強的TMZ遞送被逆轉(圖4A)。免疫電鏡圖提示，LGK974治療導致腫瘤血管內皮中caveolae介導的細胞胞吞作用顯著增加（圖4B-C）。進一步研究表明，LGK974治療導致對照小鼠中的TMZ遞送增加，但在Cav1敲除小鼠中則未受影響（圖4D）；LGK974治療導致對照小鼠腫瘤中血管內皮細胞轉吞囊泡水平增加，但在Cav1敲除小鼠中則未見其變化（圖4E-F）。此外，在Cav1敲除小鼠中，TMZ和LGK974治療對荷瘤小鼠存活率改善的協(xié)同作用也被逆轉（圖4G）。
Wnt信號通過在腫瘤血管內皮細胞中增強Mfsd2a介導的胞吞轉運作用來增加化療藥物替莫唑胺的遞送[1]
研究結論
總的來說，這項研究指出了Wnt/Mfsd2a/caveolae-mediated transcytosis軸是提高化療藥物遞送的重要靶點，揭示了Wnt/Mfsd2a信號通路調控血管內皮細胞胞吞轉運在膠質瘤藥物遞送中的分子機制，為膠質瘤的治療方案設計提供重要依據。
原文檢索：
[1]Xie Yuan, He Liqun, Zhang Yanyu, Huang Hua, Yang Fan, Chao Min, Cao Haiyan, Wang Jianhao, Li Yaling, Zhang Lingxue, Xin Lele, Xiao Bing, Shi Xinxin, Zhang Xue, Tang Jiefu, Uhrbom Lene, Dimberg Anna, Wang Liang and Zhang Lei. Wnt Signaling Regulates MFSD2A-dependent Drug Delivery through Endothelial Transcytosis in Glioma[J].Neuro Oncology. 2023 Jan 2:noac288.
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Cav1 KO小鼠
品系名稱：
C57BL/6N-Cav1em1C/Cya
品系編號：
KOCMP-12389-Cav1-B6N-VA
產品編號：
S-KO-01349
應用方向：
代謝研究,心血管系統(tǒng),腫瘤研究,神經系統(tǒng),信號轉導,肝臟/膽道系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng)
打靶方案：
Cav1 flox小鼠
品系名稱：
C57BL/6J-Cav1em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-12389-Cav1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-01561
應用方向：
代謝研究,心血管系統(tǒng),腫瘤研究,神經系統(tǒng),信號轉導,肝臟/膽道系統(tǒng),腎和泌尿系統(tǒng)
打靶方案：
Mfsd2a KO小鼠
品系名稱：
C57BL/6J-Mfsd2aem1C/Cya
品系編號：
KOCMP-76574-Mfsd2a-B6J-VA
產品編號：
S-KO-14899
應用方向：
免疫系統(tǒng),心血管系統(tǒng),神經系統(tǒng),視力/眼睛,消化系統(tǒng),肝臟/膽道系統(tǒng),行為/神經
打靶方案：
Mfsd2a flox小鼠
品系名稱：
C57BL/6J-Mfsd2aem1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-76574-Mfsd2a-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-16507
應用方向：
免疫系統(tǒng),心血管系統(tǒng),神經系統(tǒng),視力/眼睛,消化系統(tǒng),肝臟/膽道系統(tǒng),行為/神經
打靶方案：
