嵌合抗原受體（CAR）是經(jīng)過(guò)工程改造的合成受體，能重定向淋巴細(xì)胞（最常見的是T細(xì)胞），以識(shí)別和消除表達(dá)特定靶抗原的細(xì)胞。CAR與細(xì)胞表面表達(dá)的靶抗原的結(jié)合獨(dú)立于MHC受體，會(huì)導(dǎo)致劇烈的T細(xì)胞活化和強(qiáng)大的抗腫瘤反應(yīng)。現(xiàn)如今，CAR-T細(xì)胞在治療B細(xì)胞白血病或淋巴瘤的某些亞群以及多發(fā)性骨髓瘤中產(chǎn)生了顯著的臨床反應(yīng)，但同時(shí)存在多方面的局限性使其難以進(jìn)一步發(fā)揮療效，如嚴(yán)重的毒副作用、抗原逃逸、有限的腫瘤浸潤(rùn)、腫瘤微環(huán)境的抑制等。

為了更好地梳理CAR-T細(xì)胞治療的研究現(xiàn)狀，我們將從3個(gè)方面展開論述：
1. 介紹CAR結(jié)構(gòu)及其設(shè)計(jì)原則
2. 盤點(diǎn)CAR-T細(xì)胞治療的局限性及潛在風(fēng)險(xiǎn)
3. 如何打破困局、提升治療效果的創(chuàng)新策略

今天就先來(lái)講講「CAR結(jié)構(gòu)及其設(shè)計(jì)原則」的相關(guān)內(nèi)容。CAR是模塊化合成受體，由4個(gè)主要部分組成：細(xì)胞外靶抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域。

01.抗原結(jié)合域
抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是CAR中賦予靶抗原特異性的部分，通常來(lái)源于抗體的重鏈可變區(qū)（Viarable Heavy chain, VH）和輕鏈可變區(qū)（Viarablelight chain, VL），通過(guò)柔性接頭連接形成單鏈可變片段（Singlechain fragment variable, scFv）。該部分可以直接識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，進(jìn)而導(dǎo)致MHC非依賴性T細(xì)胞活化。

scFv不僅是識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)表位，還有幾個(gè)重要特征會(huì)影響CAR的功能。例如，VH鏈和VL鏈之間的交互模式以及互補(bǔ)決定區(qū)域的相對(duì)位置均會(huì)影響CAR對(duì)其靶表位的親和力和特異性。為了識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的抗原，誘導(dǎo)CAR信號(hào)傳導(dǎo)并激活T細(xì)胞，CARs抗原結(jié)合親和力必須足夠高，但不能高到導(dǎo)致表達(dá)CAR的細(xì)胞的活化誘導(dǎo)死亡并觸發(fā)毒性。為了優(yōu)化CAR與其靶抗原的結(jié)合，必須考慮其他因素，如表位位置、靶抗原密度，且避免與配體非依賴性強(qiáng)直信號(hào)傳導(dǎo)等。

02.鉸鏈區(qū)域
鉸鏈或間隔區(qū)被定義為從跨膜結(jié)構(gòu)域延伸到結(jié)合單元（scFv）的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)。鉸鏈能提供克服空間位阻的靈活性，以允許抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)入靶向表位。其長(zhǎng)度和組成差異會(huì)由多方面影響CAR-T細(xì)胞的功能，包括：結(jié)合的靈活性、CAR分子表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、表位識(shí)別、激活輸出強(qiáng)度和表位識(shí)別等。除此之外，有研究指出間隔長(zhǎng)度對(duì)于提供足夠的細(xì)胞間距離以允許免疫突觸形成也至關(guān)重要。

最常用的鉸鏈區(qū)域通常來(lái)源于CD8、CD28、IgG1或IgG4的氨基酸序列。其中，IgG衍生的間隔物可導(dǎo)致CAR-T細(xì)胞耗竭，從而降低體內(nèi)持久性，因?yàn)樗鼈兛梢耘cFcγ受體相互作用。目前一些研究試圖通過(guò)對(duì)IgG Fc受體結(jié)合部位進(jìn)行突變來(lái)克服其這一缺陷。

03.跨膜結(jié)構(gòu)域
跨膜結(jié)構(gòu)域的主要功能是將CAR錨定在T細(xì)胞膜上，但也有證據(jù)表明，它可能與CAR-T細(xì)胞功能相關(guān)。CAR跨膜結(jié)構(gòu)域可以影響CAR表達(dá)水平、穩(wěn)定性，在信號(hào)傳導(dǎo)或突觸形成中發(fā)揮作用，并與內(nèi)源性信號(hào)分子二聚化相關(guān)。

大多數(shù)跨膜結(jié)構(gòu)域來(lái)源于天然蛋白質(zhì)，包括CD3ζ、CD4、CD8α或CD28等。由于CD3ζ跨膜結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)CAR二聚化并摻入內(nèi)源性TCR，CD3ζ跨膜區(qū)可能促使了T細(xì)胞活化，但同時(shí)也降低了CAR穩(wěn)定性。另外，因?yàn)榭缒そY(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)域會(huì)影響CAR-T細(xì)胞因子的產(chǎn)生和活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（activation induced cell death, AICD），相比于CD28，具有CD8α跨膜和鉸鏈結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞釋放的TNF和IFN-γ量減少，其對(duì)AICD的敏感性降低。

總的來(lái)說(shuō)，通過(guò)將近端細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域連接到相應(yīng)的跨膜結(jié)構(gòu)域，可以促進(jìn)適當(dāng)?shù)腃AR-T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；通過(guò)使用CD8α或CD28跨膜結(jié)構(gòu)域，可以增強(qiáng)CAR表達(dá)和穩(wěn)定性。

04.胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域
在CAR分子結(jié)構(gòu)中最受關(guān)注的原件應(yīng)該是CAR共刺激結(jié)構(gòu)域。

1990年代后期設(shè)計(jì)的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信號(hào)結(jié)構(gòu)域，但由于其體外耐用性和持久性并不理想，在臨床上也僅顯示有限療效或沒有療效。

基于共刺激結(jié)構(gòu)域?qū)Τ志弥委熅哂兄匾�作用的理解，產(chǎn)生了具有一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域的第二代CAR，其在結(jié)構(gòu)上與CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的CAR-T治療產(chǎn)品中兩個(gè)最常見的共刺激域CD28和4-1BB（CD137）都與高患者反應(yīng)率有關(guān)。臨床上，第二代CAR-T細(xì)胞在慢性淋巴細(xì)胞白血病、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中產(chǎn)生了較強(qiáng)的治療反應(yīng)；關(guān)于實(shí)體瘤主要應(yīng)用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、晚期肉瘤、肝轉(zhuǎn)移瘤、卵巢癌等；此外還存在幾種替代的共刺激結(jié)構(gòu)域。

據(jù)推測(cè)，僅通過(guò)一個(gè)結(jié)構(gòu)域的共刺激會(huì)產(chǎn)生不完全激活。因此第三代CAR應(yīng)運(yùn)而生，其包含兩個(gè)與CD3ζ串聯(lián)的共刺激結(jié)構(gòu)域，但其臨床前研究產(chǎn)生了不同甚至相互矛盾的結(jié)果，在應(yīng)用轉(zhuǎn)化方面仍存在較多掣肘。
 

優(yōu)化CAR設(shè)計(jì)乃至全流程研發(fā)

CAR分子是影響CAR-T細(xì)胞治療有效性的關(guān)鍵，因此，認(rèn)識(shí)CAR分子的組成結(jié)構(gòu)，并結(jié)合研究實(shí)際情況來(lái)選擇恰當(dāng)?shù)腃AR設(shè)計(jì)，對(duì)臨床前研究有著重要作用。通過(guò)優(yōu)化CAR親和力，或是選擇適當(dāng)?shù)墓泊碳そY(jié)構(gòu)區(qū)等方式，以使CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)持久存在，并維持其殺傷功能，能進(jìn)一步確保該療法的有效性和安全性。

基于多年在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究經(jīng)驗(yàn)，賽業(yè)生物可為CAR-T/其它細(xì)胞治療研究者提供專業(yè)的定制化的CAR分子設(shè)計(jì)服務(wù)。不僅如此，我們能給予你關(guān)于CAR-T/其他細(xì)胞治療研發(fā)的全方位支持，從抗體開發(fā)、CAR病毒制備、免疫細(xì)胞制備和表型檢測(cè)，到細(xì)胞模型與動(dòng)物模型的構(gòu)建、體外/體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)一應(yīng)俱全。

參考文獻(xiàn)：
[1] Sterner RC, Sterner RM. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 2021 Apr 6;11(4):69. doi: 10.1038/s41408-021-00459-7. PMID: 33824268; PMCID: PMC8024391.