腫瘤的生長需要大量能量供給，為滿足其對能量的高需求，腫瘤細(xì)胞重編程其新陳代謝，維持他們的生存所需^[1]。營養(yǎng)充足的條件下，細(xì)胞喜歡輸入胞內(nèi)游離氨基酸來滿足其營養(yǎng)需求，但也有許多很存在于細(xì)胞外壞境中的氨基酸 (細(xì)胞外空間的蛋白質(zhì))，在饑餓或營養(yǎng)不良等嚴(yán)峻生存條件下，癌細(xì)胞以這些細(xì)胞外蛋白質(zhì)為“食”，以便艱苦條件下的茁壯成長。

細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運輸是一個高度動態(tài)和精細(xì)調(diào)控的過程^[2]，癌細(xì)胞究竟是怎樣利用細(xì)胞外蛋白質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)的呢？關(guān)鍵的因子和途徑有哪些？
   
當(dāng)癌細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏的環(huán)境時，營養(yǎng)物質(zhì)大多通過一種稱為巨胞飲作用 (macropinocytosis) 的機(jī)制來獲取。所謂巨胞飲，指細(xì)胞在被營養(yǎng)因子等刺激后，細(xì)胞膜皺縮并包裹大量外營養(yǎng)物質(zhì)，再運送到溶酶體 (細(xì)胞中至關(guān)重要的的降解區(qū)室) 中降解。溶酶體將蛋白質(zhì)分解成氨基酸, 通過產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)源以維持饑餓條件下間細(xì)胞功能。
 
 
今年 Science 雜志背靠背發(fā)表了關(guān)于溶酶體轉(zhuǎn)運因子 (LYSET) 生物功能的研究性論文的研究性論文^[3,4]，RICHARDS 團(tuán)隊等人利用 CRISPR 遺傳篩選技術(shù)鑒定出一種膜蛋白 LYSET，研究表明 LYSET 對溶酶體酶的運輸至關(guān)重要，沒有 LYSET，靶向溶酶體的運輸被嚴(yán)重破壞^[3]。

 

 

 
有必要在這里先講一下溶酶體生物發(fā)生，它是 M6P 依賴的靶向途徑，需要溶酶體蛋白質(zhì)的合成和核內(nèi)體-溶酶體運輸?shù)膮f(xié)調(diào)。包括溶酶體酶的合成，高爾基體轉(zhuǎn)運，以及識別和轉(zhuǎn)運三部曲 (圖 2)。
 

 

圖 2. 溶酶體水解酶 m6p 依賴靶向途徑^[4]

(1) 溶酶體酶的合成：溶酶體酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，在那里它們獲得 N-連接的14-糖高甘露聚糖，經(jīng)過低聚糖連接和修飾，運輸?shù)礁郀柣�體 (cis-Golgi)。 

(2) 高爾基體轉(zhuǎn)運：N-糖基化溶酶體酶寡糖鏈上的甘露糖殘基被磷酸化，經(jīng)歷一系列酶促反應(yīng)，導(dǎo)致甘露糖-6-磷酸 (Mannose-6-phosphate) M6P 基團(tuán)的加入，會形成 M6P 標(biāo)志。

(3) 識別和轉(zhuǎn)運：高爾基體 (trans 面) 某些區(qū)域分布著 M6P 受體 (M6P Receptor)，識別 M6P 標(biāo)志，具有 M6P 修飾的溶酶體酶被 MPR 識別并最后以出芽的方式形成網(wǎng)格蛋白/AP 包被小泡轉(zhuǎn)運到核內(nèi)體 (Endosome) 中。

 
 

敲黑板請注意! 高爾基體轉(zhuǎn)運過程中，M6P 修飾的形成是溶酶體生物發(fā)生的重要標(biāo)志。M6P 基團(tuán)的加入，第一步由 GlcNac-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶 (GNPT；GlcNAc-1) 完成，第二步由 M6P 揭示酶 (UCE) 完成。GlcNAc-1 的穩(wěn)定性依賴于 LYSET，沒有 LYSET, GlcNAc-1 跨膜結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定，M6P 修飾不能形成，酶向溶酶體的運輸?shù)缆繁粐?yán)重破壞, 溶酶體酶會被錯誤地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面。

 
以上為溶酶體功能發(fā)生的具體過程，那么這一過程究竟是如何被癌細(xì)胞利用，作者的研究具體如何進(jìn)行？下面的故事將圍繞 LYSET 和 GlcNAc-1 展開。
 

■ CRISPR 篩選識別 LYSET

為確定細(xì)胞外蛋白質(zhì)產(chǎn)生營養(yǎng)的細(xì)胞途徑 (前面提到有 2 種途徑，胞飲作用和溶酶體分解代謝來攝取營養(yǎng)物質(zhì)，或直接攝取單體氨基酸)，作者團(tuán)隊首先選擇了MIA PaCa-2 細(xì)胞作為初步篩選模型 (該細(xì)胞來源于胰腺癌；是一種營養(yǎng)缺乏的腫瘤類型)，實驗過程中，必需氨基酸亮氨酸 (Leu) 單體形式提供或包含在白蛋白(albumin) ( 3-4 %為生理水平，圖 3a 左), 當(dāng) Leu 缺乏，MIA PaCa-2 通過溶酶體白蛋白分解代謝在缺乏 Leu 的培養(yǎng)基中維持增殖 (圖 3b)，即以細(xì)胞外蛋白為食, 這個過程中有一個選擇性命中的突出蛋白是跨膜蛋白 LYSET (圖 3c)。

 

為了驗證這種選擇性依賴性，研究者構(gòu)建了 LYSET-KO MIA PaCa-2 細(xì)胞 (圖 3d)。在添加 3% 白蛋白但缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基中，LYSET 的缺失強(qiáng)烈抑制了所有癌細(xì)胞系的增殖和活力 (圖 3e)。在體實驗中，LYSET 缺陷的癌細(xì)胞基本無法在小鼠皮下形成腫瘤 (圖 3f)。 

 

以上結(jié)果表明，在營養(yǎng)豐富的條件下，LYSET 對于癌細(xì)胞的生長可有可無，但當(dāng)細(xì)胞外蛋白質(zhì)是必需的營養(yǎng)物質(zhì)時，體外氨基酸匱乏的條件下，LYSET 是選擇性需要的，為進(jìn)一步確定其功能，作者團(tuán)隊探索了 LYSET 在胞飲作用、單體攝入和溶酶體分解代謝中的可能作用。

 

 

圖 3. CRISPR 篩選確定 LYSET 在癌細(xì)胞使用細(xì)胞外蛋白質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)時具有選擇性

■ LYSET 是溶酶體降解 Cargos 所必需的必要因子

在 LYSET 缺失的情況下，白蛋白攝取過程和內(nèi)體貨運輸?shù)饺苊阁w沒有改變 (圖 4a 和 b；熒光標(biāo)記 Albumin 檢測白蛋白的攝取和 Dex1/2 追蹤內(nèi)吞 Cargos 到溶酶體的轉(zhuǎn)運)，但是由于溶酶體分解代謝顯著降低，熒光標(biāo)記牛血清白蛋白猝滅 (degradation BSA; DQ BSA) (圖 4c，綠色熒光標(biāo)記的減少)。

 

圖 4. LYSET 是通過溶酶體分解代謝產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)所必需的

溶酶體分解代謝是兩種代謝途徑的匯合點-胞飲和自噬 (分別可提供胞外和胞內(nèi)成分)。LYSET 的缺失會導(dǎo)致自噬體蛋白 p62 和 LC3-II 的強(qiáng)烈積累 (圖5a)，溶酶體通過各種酶分解生物分子，而在缺乏 LYSET 的細(xì)胞中，許多溶酶體酶的活性降低 (圖5b)。以上結(jié)果表明，LYSET 是通過溶酶體分解代謝產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)所必需的，它可能會影響溶酶體酶活性，使溶酶體降解貨物的能力受損。

 

圖 5. LYSET 是大胞細(xì)胞和自噬細(xì)胞的溶酶體分解代謝所必需的

■ LYSET 缺陷的細(xì)胞中，溶酶體酶的最終命運如何？
研究者進(jìn)一步測定 MIA PaCa-2 細(xì)胞的 LYSET KO 蛋白質(zhì)組的變化 (LFQ)。 LYSET 缺陷細(xì)胞 <6% 的蛋白發(fā)生了顯著變化，其中自噬貨物受體是最富集的蛋白質(zhì)之一 (圖 5a), 細(xì)胞溶酶體酶和其他溶酶體腔蛋白的整體下降 (圖 5b-c)，但是溶酶體膜蛋白豐度沒有明顯的變化 (圖 5d)。作者團(tuán)隊還測定了細(xì)胞外空間的酶水平。在 LYSET 缺陷細(xì)胞的上清液中，組織蛋白酶的未成熟形態(tài)顯著增加 (溶酶體管腔蛋白通常富集在細(xì)胞上清液中)(圖 5e)。以上結(jié)果表明，在沒有 LYSET 的情況下，大多數(shù)正常流向溶酶體腔的蛋白質(zhì)被錯誤地輸送到細(xì)胞外空間。 

 

圖 5. LYSET 缺陷的細(xì)胞中，溶酶體酶的最終命運

■ LYSET 是甘露糖-6-磷酸途徑的核心成分

前面已經(jīng)給到大家介紹過：新合成的溶酶體酶在 N-鏈聚糖鏈上接受甘露糖-6-磷酸(M6P) 修飾過程中 (GlcNAc)-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶和 M6P 揭露酶 (UCE) 發(fā)揮作用 (圖 6a)。

 

為檢測 M6P 修飾在 LYSET 缺陷細(xì)胞中的狀態(tài)，使用了一個單鏈抗體片段，專門檢測含有 M6P 的蛋白質(zhì)，LYSET 缺失會導(dǎo)致含有 M6P-modified 蛋白質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量大幅下降，這表明 LYSET 是 M6P 通路的一個組成部分。GNPTAB 編碼 GlcNAc - 1-磷酸轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的 a 和 b 亞基)，刪除 LYSET 和 GNPTAB 的任何一個基因，都會引起了 M6P 修飾 (圖 6b) 和成熟的溶酶體酶 (圖 6b-d) 的減少，即使在以細(xì)胞外蛋白為營養(yǎng)物質(zhì)的條件下，細(xì)胞增殖都會被抑制 (圖 6e)。 以上表明 LYSET 是 M6P 途徑中溶酶體酶運輸?shù)谋匾�和特定成分�?/span> 
 

圖 6. LYSET 是甘露糖-6-磷酸途徑的核心成分

 

總結(jié)

營養(yǎng)不良的條件下，細(xì)胞從環(huán)境中攝取的蛋白質(zhì)會傳遞給溶酶體，溶酶體將蛋白質(zhì)分解成組成蛋白質(zhì)的氨基酸, 產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)源，溶酶體可以在饑餓期間維持細(xì)胞功能。
 
這一過程通常被實體瘤的癌細(xì)胞利用 (如上述胰腺癌)，在這種嚴(yán)峻的生存條件下，癌細(xì)胞通常使用 LYSET/M6P 依賴的溶酶體蛋白質(zhì)分解代謝來獲取氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)。并且這種途徑是選擇性的，在營養(yǎng)充足的條件下不損害細(xì)胞活力和生長。
 
 

參考文獻(xiàn)

1.Vincent El Ghouzzi, Gaelle Boncompain. Golgipathies reveal the critical role of the sorting machinery in brain and skeletal development. Nat Commun. 2022 Dec 1;13(1):7397. 
 
2.Hua Li, Wang-Sik Lee, et al. Structure of the human GlcNAc-1-phosphotransferase αβ subunits reveals regulatory mechanism for lysosomal enzyme glycan phosphorylation. Nat Struct Mol Biol. 2022 Apr;29(4):348-356. 
 
3.Catarina Pechincha, Sven Groessl, Robert Kalis, et al. Lysosomal enzyme trafficking factor LYSET enables nutritional usage of extracellular proteins. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5637. 
 
4. Christopher M Richards , Sabrina Jabs, Wenjie Qiao, et al. The human disease gene LYSET is essential for lysosomal enzyme transport and viral infection. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5648