專注于應(yīng)用基因編輯小鼠模型，探討基因與心臟功能影響作用的基礎(chǔ)研究，賽業(yè)生物首席科學(xué)家俞曉峰博士最近對(duì)首都醫(yī)科大學(xué)羅大力教授進(jìn)行了特邀訪談，請(qǐng)羅教授基于她最近在此研究領(lǐng)域發(fā)表的相關(guān)成果，從提出研究項(xiàng)目相關(guān)假設(shè)，選擇候選基因及建立相關(guān)基因編輯小鼠疾病模型，到解析相關(guān)基因與心臟疾病致病作用機(jī)制等方面進(jìn)行深入解讀，以幫助我們更好了解與學(xué)習(xí)模式動(dòng)物基礎(chǔ)研究中的經(jīng)典思路與策略，為今后基因功能相關(guān)的模式動(dòng)物基礎(chǔ)研究工作，提供有價(jià)值及實(shí)際應(yīng)用的參考意義。

本專訪是基于羅老師最近在發(fā)表在Circulation和Cell Death & Differentiation期刊上的相關(guān)文章為基礎(chǔ)，拋磚引玉出相關(guān)問題，以求共同探討交流與學(xué)習(xí)。

俞曉峰博士：根據(jù)集鈣蛋白（Casq1）基因不同組織表達(dá)特征，該基因在人體骨骼肌中表達(dá)量較高，而在心臟組織轉(zhuǎn)錄水平很低，蛋白表達(dá)未見報(bào)道，羅老師為什么會(huì)選擇將該基因敲除在心臟組織特異性敲除的策略，評(píng)價(jià)基因缺失對(duì)心臟功能的影響作用？

羅大力教授：首先感謝賽業(yè)生物為我們構(gòu)建了高效精準(zhǔn)的基因模式動(dòng)物，使我們能夠從動(dòng)物整體水平系統(tǒng)研究關(guān)鍵蛋白的功能。

集鈣蛋白是肌漿網(wǎng)鈣貯存蛋白，使肌細(xì)胞在興奮時(shí)有效釋放出游離的鈣離子進(jìn)入胞漿，產(chǎn)生肌肉收縮。已發(fā)現(xiàn)二種集鈣蛋白亞型，1型和2型（Casq1和Casq2）。哺乳動(dòng)物的Casq1主要表達(dá)在骨骼肌，而Casq2只表達(dá)在心肌，二者均與人類遺傳疾病密切相關(guān)。Casq1缺失可引起骨骼肌損傷和高熱，即惡性高熱病（MH），Casq2缺失可致兒茶酚胺多形性室性心律失常（CPVT）。有趣的是在已報(bào)道的大量MH患者中除骨骼肌癥狀外，也發(fā)生心動(dòng)過速和室性心律失常，但病生理的機(jī)理并不清楚。我們?cè)谇捌谘芯刻悄虿⌒募〔�時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)動(dòng)物心臟除表達(dá)Casq2外，也表達(dá)Casq1亞型。因此，令我們想到MH的心臟問題是否與這個(gè)心臟表達(dá)的Casq1有關(guān)？心肌細(xì)胞的結(jié)果使我們有信心進(jìn)一步構(gòu)建了心臟特異性Casq1敲除鼠進(jìn)行系統(tǒng)性Casq1在心臟的功能和病理意義的研究。

俞曉峰博士：羅老師應(yīng)用我們構(gòu)建的Casq1條件性打靶（floxed）小鼠模型，不僅用該floxed小鼠與心臟特異性表達(dá)Cre小鼠交配繁殖，以研究Casq1基因在心臟組織敲除后對(duì)心臟功能損傷的影響及其作用機(jī)制。同時(shí)，還用該floxed小鼠與全身表達(dá)Cre小鼠交配繁殖，實(shí)現(xiàn)全身敲除Casq1基因的目的，通過對(duì)不同敲除策略小鼠模型的比較研究，羅老師能否分享一下從中獲得了哪些不一樣的發(fā)現(xiàn)或意外收獲？

羅大力教授：我們認(rèn)為做基礎(chǔ)研究最重要的使命是解決臨床中發(fā)現(xiàn)的問題，為臨床未知的疾病或疾病發(fā)生的病生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和有效的治療思路和策略�；颊甙l(fā)生基因遺傳性疾病是影響全身該基因相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮功能。因此，構(gòu)建心臟條件性基因模式動(dòng)物以排除骨骼肌Casq1改變的影響同時(shí)，再制備全身性Casq1敲除鼠模擬人類的病理狀態(tài)對(duì)解決相關(guān)疾病的病生理機(jī)制具有重要的支持作用。

有意義的是全身和心臟條件性Casq1基因敲除鼠在心臟的疾病表型完全相似，甚至心臟條件性敲除鼠的心律失常癥狀更為嚴(yán)重，說明MH的心臟癥狀與骨骼肌損傷無關(guān)（目前認(rèn)為MH心動(dòng)過速和室性心律失常與骨骼肌損傷釋放的大量酸性產(chǎn)物，炎性因子和自由基有關(guān)），而是由于心臟的Casq1蛋白表達(dá)減少直接造成的。

俞曉峰博士：我們注意到，羅老師在研究中通過應(yīng)用藥物（比如2% 異弗烷麻醉劑），或41℃高溫來誘導(dǎo)Casq1敲除小鼠模型，構(gòu)建相應(yīng)的小鼠疾病模型，研究該基因?qū)π呐K功能的影響作用。是不是可以理解為，如果沒有這些誘導(dǎo)因素的參與，只是Casq1基因的敲除，很難觀察到明顯表型改變？能否分享一下你們?nèi)绱嗽O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的想法與依據(jù)？

羅大力教授：臨床患者發(fā)生MH或CPVT都是在特定條件下；MH經(jīng)常是在氣體麻藥使用中或高溫環(huán)境，或劇烈的運(yùn)動(dòng)條件下發(fā)生，CPVT是在激烈運(yùn)動(dòng)條件下發(fā)生。因此，我們模擬臨床癥狀誘導(dǎo)環(huán)境（麻藥或高熱）產(chǎn)生完全相似的表型，說明Casq1在MH發(fā)生中的關(guān)鍵作用。作為基礎(chǔ)研究工作者，更重要的是回答和解決為什么通常情況下沒有癥狀，需在這些誘導(dǎo)因素存在的條件下發(fā)生致命性心律失常，由于突然發(fā)生而不能快速而有效救治，其死亡率高達(dá)90%。通過研究我們發(fā)現(xiàn)在2種Casq1敲除鼠，Casq1蛋白的多聚體表達(dá)輕度減少，而單體，二聚體/三聚體下調(diào)非常明顯。在麻藥和高溫條件下Casq1多聚體解聚成單體/二聚體/三聚體，最終使Casq1整體水平更加減少是MH心臟表型的病理生理基礎(chǔ)。說明Casq1生理功能主要是通過多聚體與蘭尼定受體（Ryanodine receptor）結(jié)合，抑制其活性，減少鈣庫(kù)動(dòng)員。在MH誘因條件下，對(duì)正常人多聚體的減少不足以產(chǎn)生疾病表型，而Casq1發(fā)生變異時(shí)，Casq1的減少凸顯，或蘭尼定變異時(shí)，誘因的存在使Casq1的減少不足以抑制已改變的蘭尼定受體，進(jìn)而發(fā)生異常鈣釋放和心律失常。以上結(jié)果說明心臟Casq1改變與臨床疾病表型高度吻合，因此，解決了MH發(fā)生的室性心律失常的病生理機(jī)制以及解救藥丹曲洛林發(fā)揮治療作用的理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，這些研究也提出一些有趣的問題需要進(jìn)一步研究和闡釋，比如為什么Casq1多聚體在生理?xiàng)l件下難以有效完全敲除等，我們也就此類問題曾經(jīng)通話討論過，認(rèn)為這可能與研究所用的心臟特異性Cre小鼠本身特性等相關(guān)因素有關(guān)。

此外，我們?cè)谶@二種基因鼠中還發(fā)現(xiàn)其他心臟的表型，即在不需要誘導(dǎo)因素存在的基礎(chǔ)情況下表現(xiàn)出明顯的心臟病理性改變，這些表型的發(fā)生也與Casq1多聚體的多少有關(guān)。這是我們以后進(jìn)一步重點(diǎn)研究的內(nèi)容。

俞曉峰博士：縫隙連接蛋白Cx43磷酸化修飾有利于心臟發(fā)揮其正常功能，而相應(yīng)的去磷酸化修飾則可引起心肌細(xì)胞死亡與心律失常等破壞反應(yīng)，在已報(bào)道的Cx43基因約10個(gè)去磷酸化位點(diǎn)中，羅老師為什么會(huì)選擇pS282A位點(diǎn)進(jìn)行深入研究？

羅大力教授：縫隙連接蛋白Cx43構(gòu)成的縫隙通道是心肌非常重要的細(xì)胞間通訊工具，在多種心臟疾病中，Cx43發(fā)生重構(gòu)，進(jìn)而參與心肌細(xì)胞電紊亂致心律失常和心肌病理性損傷。生理情況下，Cx43磷酸化是極為重要的調(diào)節(jié)Cx43通道功能，以及心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)翻譯后修飾形式。在心肌缺血，肥大，心衰和電異常患者和模型動(dòng)物心臟中發(fā)現(xiàn)Cx43去磷酸化與心肌病理改變密切相關(guān)，但具體直接介導(dǎo)心肌損傷的下調(diào)磷酸化位點(diǎn)不清。十幾年前偶然間發(fā)現(xiàn)一個(gè)藥物可以引起心肌細(xì)胞電活動(dòng)不一致，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該藥物可使Cx43絲氨酸282位點(diǎn)磷酸化下調(diào)，進(jìn)一步在藥物作用的心肌細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后竟然導(dǎo)致部分死亡。由此推斷Cx43-S282位點(diǎn)磷酸化是心肌細(xì)胞電和生存穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

俞曉峰博士：縫隙連接蛋白Cx43基因全身敲除會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙，敲除純合小鼠出生后很快死亡。我們應(yīng)用ES打靶技術(shù)構(gòu)建的Cx43點(diǎn)突變（S282A）小鼠，也難以獲得純合點(diǎn)突變小鼠，且雜合S282A突變小鼠，也有約30%小鼠出生后20天內(nèi)死亡，而其他雜合突變小鼠都會(huì)自發(fā)出現(xiàn)不同程度的心律失常等表型，這是非常有意思發(fā)現(xiàn)，羅老師對(duì)于這種基因突變位點(diǎn)相同，且表現(xiàn)不同程度的表型改變現(xiàn)象，應(yīng)該如何解釋或可能性推測(cè)嗎？

羅大力教授：心臟中縫隙連接蛋白Cx43具有重要的多重功能，它主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，但大量的研究發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，線粒體功能和組織發(fā)生及發(fā)育中等具有極其重要的調(diào)節(jié)作用。心肌缺血性損傷、心衰時(shí)心功下降和結(jié)構(gòu)的改變以及心律失常等都與Cx43的功能及其結(jié)構(gòu)改變密切相關(guān)。Cx43-S282單一磷酸位點(diǎn)突變?yōu)楸�氨酸，即不能被磷酸化，呈現(xiàn)出無純合子代，雜合子代有典型的心肌細(xì)胞凋亡和動(dòng)物死亡，以及生存下來的動(dòng)物帶有持續(xù)一生的心律失常。迄今對(duì)十幾種Cx43磷酸化位點(diǎn)的研究報(bào)道還未見發(fā)生如此重要的功能作用，說明這個(gè)位點(diǎn)對(duì)于Cx43蛋白功能的維系極其重要，是關(guān)鍵分子。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，那些發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡的雜合動(dòng)物S282磷酸化水平是最低的（下降>50%），心律失常最重的，幾乎也是100%發(fā)生死亡的動(dòng)物。而存活下來的動(dòng)物磷酸化下降約30%左右，只表現(xiàn)出心肌的縫隙通道傳導(dǎo)障礙和各種心律失常，包括室性心律失常。因此，這個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平改變呈現(xiàn)層級(jí)遞階的表型，當(dāng)然其背后的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制是不同的。這些都充分體現(xiàn)了Cx43在心肌電和生存穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用，而S282位點(diǎn)極可能是發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，或關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。

俞曉峰博士：通過手術(shù)操作，在動(dòng)物體內(nèi)建立缺血再灌注動(dòng)物疾病模型，已成為心臟損傷相關(guān)研究的傳統(tǒng)常用方法，而如何將獲得的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床相關(guān)患者實(shí)際情況聯(lián)系起來，也將顯得很有意義，比如臨床上心律失�；蛐募」Ｈ�患者人群中，是否也存在Cx43基因pS282A位點(diǎn)突變及其相關(guān)性如何？

羅大力教授：這是一個(gè)非常好的問題。既然Cx43-S282位點(diǎn)極可能是發(fā)揮Cx43調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，或關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，也參與了動(dòng)物的缺血再灌注損傷和心律失常的發(fā)生。那么，在人類疾病中是否有它改變的蹤跡呢？這是我們下一步重點(diǎn)要研究的內(nèi)容。目前在收集病人的心臟樣本，但尋找相對(duì)正常的對(duì)照病人的樣本非常難，如果能夠找到愿意合作的單位和研究人員就更好。

俞曉峰博士：由于Casq1基因缺失或Cx43基因S282位點(diǎn)的去磷酸化修飾，都會(huì)不同程度影響到心臟正常功能作用，未來是否有可能應(yīng)用基因編輯方法，比如替代相關(guān)野生基因或修正突變基因等基因療法，達(dá)到緩解或治療心臟相關(guān)疾病的作用？

羅大力教授：這又是一個(gè)非常好的轉(zhuǎn)化問題。我們的研究發(fā)現(xiàn)Cx43-S282位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維系中極其重要，這里不僅僅是其磷酸化下調(diào)與該調(diào)節(jié)作用有關(guān)，如果超過正常2倍的磷酸化上調(diào)也是極其危險(xiǎn)信號(hào)，會(huì)出現(xiàn)另一種形式的細(xì)胞凋亡和電紊亂。因此，在未來可能的治療策略中我們考慮應(yīng)以化藥為首選，這主要是化藥的劑量可控及作用時(shí)間短。目前我們也在這方面做嘗試。

專家簡(jiǎn)介

羅大力，首都醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系教授，博士生導(dǎo)師

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)碩士和生理學(xué)博士畢業(yè)，北京大學(xué)心血管研究所病理生理學(xué)博士后。曾在日本新瀉大學(xué)和美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院學(xué)習(xí)和合作研究。研究方向是心血管藥理學(xué)：主要從事心臟和血管相關(guān)疾病的病生理學(xué)，和藥物作用及其作用機(jī)制研究，尤其是心衰，心律失常和心肌梗死發(fā)生和發(fā)展的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，以探尋新的藥物靶點(diǎn)并進(jìn)行潛在新藥研發(fā)。主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目8項(xiàng)和省部級(jí)各類項(xiàng)目9項(xiàng)。獲省部級(jí)科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)7項(xiàng)。在國(guó)內(nèi)外雜志發(fā)表80余篇學(xué)術(shù)論文，SCI收錄第一和責(zé)任作者60余篇。

俞曉峰，賽業(yè)生物中國(guó)區(qū)副總裁兼首席科學(xué)家

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士，國(guó)際知名模式動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)專家，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員，美國(guó)基因打靶公司（iTL）和應(yīng)用干細(xì)胞公司（ASC）資深科學(xué)家。在基因修飾模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過20多年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol等高水平雜志上。

相關(guān)文獻(xiàn)

1. Functional calsequestrin-1 is expressed in the heart and its deficiency is causally related to malignant hyperthermia-like arrhythmia. Circulation, 2021

2. Connexin 43 dephosphorylation at serine 282 is associated with connexin43-mediated cardiomyocyte apoptosis. Cell Death & Differentiation, 2019

3. Connexin 43 dephosphorylation contributes to arrhythmias and cardiomyocyte apoptosis in ischemia/reperfusion hearts. Cell Death & Differentiation, 2019