Part 1：產(chǎn)品選擇
 
：我要買 Human EGF 用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，網(wǎng)上一查，好多種相似產(chǎn)品，我該如何選擇？
：重組蛋白選擇，有幾個(gè)重點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)，我給你們列出來(lái)了！

 

圖 1. 重組蛋白表達(dá)步驟
 

選擇因素 1：研究目的
在選擇產(chǎn)品前，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康模�可排除一些干擾因素。

 

 

圖 2. 重組蛋白表達(dá)體系的選擇和對(duì)比

 

選擇因素 2：產(chǎn)品特性

 

活性數(shù)據(jù) (Biological Activity)

ED₅₀ 半數(shù)有效量 (Median effective dose, ED₅₀) 在量反應(yīng)中指能引起 50% 最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起 50% 實(shí)驗(yàn)對(duì)象出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)的藥量。一般是通過(guò)其在標(biāo)準(zhǔn)化條件下對(duì)特定細(xì)胞類型的影響 (例如刺激細(xì)胞增殖) 來(lái)測(cè)量的。

 
小貼士：如何將 ED₅₀ 轉(zhuǎn)換為比活力單位？
: 如下圖中，通過(guò)Human EGF 劑量依賴性刺激小鼠 BALB/c 3T3細(xì)胞增殖，ED₅₀ <0.2 ng/mL。
 

 

一個(gè)活性單位是每毫升具有最大響應(yīng)作用 50% 的細(xì)胞因子的數(shù)量：

Human EGF 1 個(gè) unit (1U) 就是 0.2 ng/mL，每 1 mg 的 Human EGF 的活力值 (unit) 為:

 

 

即 Human EGF 的比活力為 5.0 × 10⁶ units/mg。

計(jì)算當(dāng)然也是有捷徑的：

進(jìn)入公眾號(hào) “MCE 抑制劑”-重組蛋白復(fù)溶計(jì)算器-比活力計(jì)算器

 

 

Part 2：老生常談—重組蛋白復(fù)溶及保存
 
：由于工藝原因，蛋白凍干粉產(chǎn)品會(huì)呈現(xiàn)粉末狀或肉眼不易觀察到的透明薄膜狀、膠凍狀、雪花狀，這些都是正�，F(xiàn)象。凍干的體積大小也會(huì)受凍干前緩沖液組分、鹽離子濃度、產(chǎn)品濃度等影響。此外，在運(yùn)輸過(guò)程中，凍干顆�？赡軙�(huì)分散，并粘附于瓶壁和瓶蓋。
MCE 保證每管產(chǎn)品的蛋白總量達(dá)到標(biāo)示含量。說(shuō)到這里，講講怎么更好地溶解重組蛋白吧~

 

第一步：開(kāi)蓋前需離心

在開(kāi)蓋使用之前，需先離心，將凍干粉收集于管底。實(shí)驗(yàn)操作: 10,000-12,000 rpm 離心 30 s，若沒(méi)有高速離心機(jī)，3000-3500 rpm，離心 5 mins。
 
 
 
第二步：產(chǎn)品復(fù)溶

還是以 Human EGF 為案例；10 μg 規(guī)格溶解

敲黑板：無(wú)論長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)還是短期實(shí)驗(yàn)，溶解的濃度不低于 100 μg/mL��！

 

短期實(shí)驗(yàn)：使用復(fù)溶 Buffer 直接溶解的重組蛋白，液體可在 2-8℃ 最長(zhǎng)保存 1 周。對(duì)于周期較短的實(shí)驗(yàn) (不超過(guò) 7 天)，可以直接取該條件下保存的細(xì)胞因子或者重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可，一周之內(nèi)用完。
(復(fù)溶 Buffer: 可參考重組蛋白使用指南里建議的溶液或者使用已貼心搭配好的蛋白伴侶）
 
長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)：以下步驟供參考：
1、先加 20-30 μL 建議復(fù)溶液 

 

 

2、再加 70-80 μL 含載體蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 或 5% 海藻糖) 的緩沖液/培養(yǎng)基

3、分裝大于 20 μL/管
 
 
 

第三步：產(chǎn)品保存

用復(fù)溶 Buffer 重懸的蛋白溶液用含載體蛋白 (0.1% BSA, 5% HAS, 10% FBS, 5% 海藻糖) 的溶液稀釋后，-20℃ 可保存至少三個(gè)月。

 

Part 3：產(chǎn)品細(xì)節(jié)篇
 

：以下一些小細(xì)節(jié)也要注意。

 

1、溶解過(guò)程中不要采用渦旋震蕩輔助溶解

上期給大家說(shuō)到：化合物的溶解可以借助水浴、超聲、渦旋、震蕩等方法助溶。但對(duì)于重組蛋白來(lái)說(shuō)，具備一定的空間結(jié)構(gòu)會(huì)使其活性更佳。

正確操作：移液器槍頭輕輕吹打混勻或者上下顛倒混勻。若無(wú)法做到充分溶解，可以將復(fù)溶產(chǎn)品至于水平搖床低速搖一段時(shí)間或 4℃ 靜置 2 h 以上。

 

 

2、稀釋用的含載體蛋白的溶液選擇

特別注意的是，稀釋用的含載體蛋白的溶液是指有一定緩沖能力、pH 值為中性的溶液，如 PBS、培養(yǎng)液 DMEM 或者 RPMI1640 等。不可直接用水來(lái)代替。

 

3、不同重組蛋白之間是否可以交叉使用？
重組蛋白的種屬交叉活性需要根據(jù)具體產(chǎn)品而定；建議盡量選擇對(duì)應(yīng)種屬。如實(shí)在無(wú)法匹配種屬：
 
a . 大多數(shù)人細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞有效 (僅少數(shù)例外)。
b. 干擾素，GM-CSF，IL-3，IL-4 具有種屬特異性，例如重組人的這些細(xì)胞因子只能作用于人細(xì)胞，對(duì)小鼠和大鼠等其他種屬無(wú)效果。 
c. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGFs)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素 (Neurotrophins，如 BDNGF/GDNF/CNTF/β-NGF 等)、TGF-β  等高度保守，各種屬間交叉活性強(qiáng)。
d. 同源交叉性的比對(duì)：打開(kāi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站 Uniport，進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)。
 以上信息僅供參考，畢竟文獻(xiàn)是最好的老師。

 

4、有些蛋白帶了標(biāo)簽，有什么作用？

重組蛋白的融合標(biāo)簽是在目的蛋白 N 端或 C 端進(jìn)行融合表達(dá)的特定蛋白、多肽或寡肽標(biāo)簽。常用的標(biāo)簽有 His、GST、MBP、Trx、TF、MBP、Nus、SUMO、Flag 和 Fc 等。