在生物醫(yī)學(xué)研究中，低背景成像是至關(guān)重要的。熒光成像不可避免地會出現(xiàn)光漂白和相對較高的自發(fā)熒光背景。近年來，余輝發(fā)光（afterglow luminescence）吸引了人們的注意力。余輝發(fā)光材料存儲了輻照的光能，在激發(fā)光停止后仍能持續(xù)發(fā)光。古代的夜光杯、夜明珠等便是由這種材料制成。

余輝發(fā)光能夠避開熒光成像的缺點，在體內(nèi)無背景成像中具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為活體成像的替代方案，應(yīng)用于細(xì)胞追蹤、癌癥成像、血管可視化等。不過，現(xiàn)有余輝材料存在結(jié)構(gòu)惰性，響應(yīng)位點不足，這使得可激活余輝探針的設(shè)計變得相當(dāng)困難。同時，余輝強度的衰減也影響人們準(zhǔn)確定量分析物。

為此，湖南大學(xué)譚蔚泓院士、張曉兵教授、宋國勝教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊提出一種比率余輝發(fā)光納米平臺，可用于定制各種可激活的余輝探針，并對特定分析物進(jìn)行可靠的定量和分子成像。這項研究成果發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。
 

研究材料和方法
在這項研究中，體外實驗使用了4T1和RAW264.7巨噬細(xì)胞，體內(nèi)實驗則使用了Nos2^−/−小鼠和野生型小鼠（這兩種小鼠均購自賽業(yè)生物）。研究人員在制備出RAN1、RAN2和RAN3探針后，測定了熒光和余輝成像。在實驗過程中，他們使用了流式細(xì)胞分析、免疫熒光分析、細(xì)胞凋亡分析等。

技術(shù)路線
01比率余輝發(fā)光納米平臺的設(shè)計
02三種比率余輝探針的制備，分別響應(yīng)NO、ONOO⁻和pH
03從多方面評估比率余輝探針的性能
04利用比率余輝探針進(jìn)行活體成像
05利用比率余輝探針來評估巨噬細(xì)胞極化

研究結(jié)果
1.比率余輝發(fā)光納米平臺的設(shè)計
研究人員提出了一種基于余輝的能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，稱為“余輝共振能量轉(zhuǎn)移”（ARET），它融合了FRET和余輝發(fā)光的優(yōu)點。在ARET中，F(xiàn)RET的供體熒光團被余輝底物取代。在激光輻照后，余輝底物產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體來存儲能量，之后能量被轉(zhuǎn)移到能量受體，在輻照停止后發(fā)出另一道余輝。因此，可通過兩次發(fā)光的自校準(zhǔn)來實現(xiàn)比率余輝成像，有效解決余輝衰減帶來的問題。

基于這種ARET策略，作者隨后設(shè)計出一種通用的比率式余輝納米平臺（RAN）。它通過自組裝策略整合響應(yīng)分子（NRM、ORM或PRM）、余輝底物（MEHPPV）、表面活性劑（F127）和余輝引發(fā)劑（TPP或BDP）來定制可激活的余輝探針，以實現(xiàn)生物目標(biāo)的定量（圖1）。
 

圖1 基于ARET的比率余輝納米平臺的示意圖

2.多個比率余輝納米探針的設(shè)計
通過引入不同的響應(yīng)分子作為能量受體，可輕松制備各種可激活的比率余輝納米探針。在概念驗證研究中，研究人員設(shè)計了一氧化氮（NO）響應(yīng)性的納米探針RAN1，然后系統(tǒng)研究了它對NO的響應(yīng)。正如預(yù)期的那樣，隨著NO濃度的增加，RAN1在600nm處的余輝發(fā)光（AF1）減弱，而在830nm處的余輝發(fā)光（AF2）增強，表現(xiàn)出RAN1對NO的響應(yīng)，而且余輝比（AF2/AF1）與NO濃度呈線性相關(guān)。這些結(jié)果表明，RAN1是一種出色的納米探針，可用于NO的余輝成像，并具有高的靈敏度和特異性。

為了證明這個納米平臺的通用性，研究人員又開發(fā)出兩種納米探針RAN2和RAN3，來響應(yīng)過氧亞硝基陰離子（ONOO⁻）和pH（圖2）。分析結(jié)果表明，基于ARET的策略也適用于ONOO⁻或pH的靈敏檢測和成像，這進(jìn)一步證實了比率余輝納米平臺在開發(fā)余輝探針上的可行性和普適性。
 

圖2 余輝探針對不同分子的響應(yīng)

值得注意的是，后續(xù)的實驗表明，這些比率余輝探針不僅可解決余輝強度的衰減問題，消除激光功率、輻照時間和曝光時間的干擾，而且還顯著提高了體內(nèi)成像的可靠性和信噪比（約1200倍）。

3.利用比率余輝成像來評估巨噬細(xì)胞極化
為了驗證RAN1對NO成像的能力，研究人員在LPS誘導(dǎo)的肝損傷實驗中使用Nos2^−/−小鼠作為對照（該Nos2^−/−小鼠購自賽業(yè)生物）。對于WT小鼠，LPS的處理可顯著提高余輝強度比（AF2/AF1），表明LPS孵育的小鼠肝臟中的NO含量較高。但對于Nos2^−/−小鼠，LPS的處理并沒有引起AF2/AF1顯著增加，這是由于Nos2基因的敲除導(dǎo)致NO無法產(chǎn)生。由此可見，RAN1能夠通過比率余輝成像檢測活體小鼠的內(nèi)源性NO。

在此基礎(chǔ)上，他們預(yù)計RAN1有潛力對RAW264.7巨噬細(xì)胞的極化進(jìn)行成像。他們使用多種調(diào)節(jié)劑來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）轉(zhuǎn)化為殺傷腫瘤的M1表型，從而影響內(nèi)源性NO水平。實驗結(jié)果表明，使用比率余輝成像，RAN1能夠?qū)崟r檢測巨噬細(xì)胞極化過程中的NO變化，作為評估極化程度的有效參數(shù)（圖3）。這種比率信號可作為無創(chuàng)預(yù)測因子來實時評估巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫治療的效果。
 

圖3 巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療的余輝成像

研究結(jié)論
綜上，研究人員受到FRET的啟發(fā)，設(shè)計出一種通用的比率余輝納米平臺�；�于ARET的比率探針不僅克服了余輝強度的衰減，消除了其他因素的干擾，而且表現(xiàn)出更高的成像可靠性，可用于分析物的定量分析。未來，這種納米平臺有望應(yīng)用于巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫療法的無創(chuàng)評估，或活體動物中免疫治療調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。