前言
 

抗體（antibody）是指機(jī)體由于抗原的刺激而產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，是由漿細(xì)胞分泌并參與體液免疫的重要分子。眾所周知，抗體被廣泛用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、病理診斷、檢測(cè)試劑盒和藥物的研發(fā)。
 

 針對(duì)不同應(yīng)用的抗體來(lái)設(shè)計(jì)不同的抗原是抗體開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵第一步�？乖�，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。

 

為研發(fā)生產(chǎn)最優(yōu)質(zhì)的抗體，華安生物的小伙伴在免疫原設(shè)計(jì)上經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的摸索，積累了多年經(jīng)驗(yàn)。今天，小編就將免疫原設(shè)計(jì)策略分享給大家~

 

常用的免疫原有很多種，如多肽、蛋白、小分子、核酸、糖類及細(xì)胞等，但如今最常見(jiàn)的免疫原還是以多肽和蛋白為主。

根據(jù)抗體的應(yīng)用不同，我們對(duì)免疫原的設(shè)計(jì)策略也有所不同。
 

PART01 應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究的抗體研發(fā)

 

該類抗體的免疫原一般設(shè)計(jì)為多肽或制備蛋白的片段。目前有不同網(wǎng)站可以用于參考設(shè)計(jì)多肽，該免疫原設(shè)計(jì)需考慮多肽親水性、免疫反應(yīng)性及種屬特異性這三點(diǎn)。如http://tools.iedb.org/main/,該網(wǎng)站列出了B細(xì)胞表位，T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。

 

 

通過(guò)比對(duì)不同種屬的蛋白序列來(lái)比較種屬特異性，以便測(cè)試設(shè)計(jì)的多肽在不同種屬中的差異。

 

圖2：HSP27人蛋白，小鼠蛋白和大鼠蛋白的序列比對(duì)

通過(guò)序列比對(duì)圖，我們可以根據(jù)最終的抗體要求，進(jìn)行序列設(shè)計(jì)。若需要抗體能同時(shí)識(shí)別不同種屬，設(shè)計(jì)時(shí)則優(yōu)先考慮序列一致的區(qū)域；若只需要抗體能特異性識(shí)別人蛋白或是小鼠蛋白，設(shè)計(jì)時(shí)就需要找出特異性的片段。圖中*表示氨基酸在不同種屬中是一致的。

 

圖3：蛋白的三位結(jié)構(gòu)，該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，有折疊區(qū)，也有線性區(qū)域

 

 

蛋白三維結(jié)構(gòu)在多肽設(shè)計(jì)考慮中也是至關(guān)重要的。常見(jiàn)的B細(xì)胞抗原表位一般會(huì)選擇線性區(qū)域，而非折疊區(qū)域或螺旋區(qū)域。但T細(xì)胞抗原表位設(shè)計(jì)則需考慮蛋白的空間構(gòu)象，將目的區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸設(shè)計(jì)成多肽。

 

Tips

通過(guò)不同的軟件或是預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行多肽設(shè)計(jì)后，根據(jù)研究目的，確定所研發(fā)的抗體需要特異性識(shí)別該蛋白，或是能識(shí)別該蛋白的同源蛋白，進(jìn)行序列blast。根據(jù)blast的結(jié)果，預(yù)先判斷所設(shè)計(jì)的多肽的同源性。

 

 
PART02 應(yīng)用于針對(duì)修飾性位點(diǎn)的抗體研發(fā)

 

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對(duì)生命活動(dòng)有著重要作用，如磷酸化，乙�；�，甲基化等。針對(duì)該類抗體研發(fā)，設(shè)計(jì)免疫原的策略主要是設(shè)計(jì)相應(yīng)的修飾位點(diǎn)多肽。
 

首先找到修飾位點(diǎn)，如磷酸化，根據(jù)磷酸化位點(diǎn)附近的氨基酸序列，設(shè)計(jì)15-20個(gè)氨基酸的多肽，應(yīng)用軟件或網(wǎng)站預(yù)測(cè)該磷酸化位點(diǎn)附近的多肽的免疫反應(yīng)性，挑選反應(yīng)性最高的序列作為免疫原，并進(jìn)行種屬特異性的檢查和非同源蛋白的比對(duì)。在合成含修飾位點(diǎn)的多肽的同時(shí)，也需要合成該位點(diǎn)無(wú)修飾的多肽用于交叉檢測(cè)，最終獲取針對(duì)特異性位點(diǎn)的抗體。

 

Tips

根據(jù)研究目的的不同，有時(shí)需要抗體既可識(shí)別修飾后的蛋白，又可識(shí)別無(wú)修飾的蛋白，即pan抗體。針對(duì)這類抗體，篩選時(shí)需要能識(shí)別兩種多肽。

 

 
PART03 應(yīng)用于試劑盒配對(duì)用抗體

 

試劑盒配對(duì)用抗體通過(guò)識(shí)別蛋白不同表位來(lái)檢測(cè)樣品中目的蛋白的含量。因此設(shè)計(jì)此類免疫原應(yīng)先調(diào)研該蛋白的整體結(jié)構(gòu)、整個(gè)蛋白的大小以及是否含有剪切片段；進(jìn)而根據(jù)調(diào)研的信息設(shè)計(jì)蛋白片段�；蛑苽淙�長(zhǎng)蛋白，或制備蛋白片段�？贵w篩選根據(jù)陽(yáng)性抗體進(jìn)行表位預(yù)測(cè)，針對(duì)不同表位的抗體進(jìn)行配對(duì)檢測(cè)，最終獲取需要的抗體對(duì)用于試劑盒后期的研發(fā)。

 

圖4：針對(duì)M1102項(xiàng)目蛋白免疫并獲取的單克隆抗體

該實(shí)驗(yàn)用6B9作為競(jìng)爭(zhēng)抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：克隆A5A7與A4A8的結(jié)合位點(diǎn)與6B9不同；克隆A3F5的結(jié)合位點(diǎn)與6B9類似；克隆A4A7的結(jié)合位點(diǎn)與6B9有部分相似。因此我們?cè)谶M(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，可以優(yōu)先挑選結(jié)合位點(diǎn)不同的抗體進(jìn)行配對(duì)，如6B9-A4A8, A4A7-A4A8等。

 
PART04 應(yīng)用于抗體藥物的研發(fā)
 

抗體藥物的研發(fā)指針對(duì)不同的藥物靶標(biāo)，進(jìn)行大量的抗體藥物前提的研發(fā)。

用于藥物研發(fā)的抗體，免疫原設(shè)計(jì)要求更為嚴(yán)格，目前免疫階段采用真核表達(dá)的蛋白。抗體藥物靶標(biāo)主要分為兩類，分泌型靶標(biāo)（VEGF, IL-6, IL-17等）和跨膜蛋白（PD-1， BCMA, EGFR等）。

分泌型靶標(biāo)，一般直接制備真核表達(dá)的蛋白用于免疫。蛋白制備后對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)、細(xì)胞的增殖作用以及與相應(yīng)配體的結(jié)合實(shí)驗(yàn)等，以確保所制備的免疫原是有活性的蛋白。

跨膜蛋白，所制備蛋白的策略會(huì)有不同，如下圖所示。

 

 

 

上圖蛋白為I型膜蛋白，胞外區(qū)為蛋白的結(jié)合區(qū)，胞內(nèi)為蛋白的活性區(qū)域。在設(shè)計(jì)免疫原的時(shí)候，有兩個(gè)策略。一是設(shè)計(jì)胞外的結(jié)合區(qū)，制備蛋白；二是用過(guò)表達(dá)該蛋白的細(xì)胞作為免疫原。設(shè)計(jì)免疫原后，利用相應(yīng)的需要設(shè)計(jì)檢測(cè)的蛋白進(jìn)行抗體的篩選。有時(shí)蛋白的胞外區(qū)會(huì)有不同的結(jié)構(gòu)域，如IgC結(jié)構(gòu)域，α亞基，β亞基等（圖4），針對(duì)此類蛋白，根據(jù)文獻(xiàn)，可以找出最重要的結(jié)合結(jié)構(gòu)域制備蛋白。最佳策略是制備胞外區(qū)的片段以及含特殊結(jié)構(gòu)的蛋白用于免疫，效果更佳。

 

Tips

利用過(guò)表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行免疫，可以使蛋白以天然狀態(tài)展示在細(xì)胞表面，并結(jié)合蛋白篩選和細(xì)胞篩選，這樣得到的抗體，其結(jié)合活性更佳。

 
PART05 其他特殊的抗體

 

對(duì)于不同研究目的需制備不同的抗體。如針對(duì)特殊結(jié)合位點(diǎn)的抗體研發(fā)。

圖7：某蛋白與小分子的結(jié)合示意圖。

 

小分子與該蛋白的結(jié)合位點(diǎn)為一邊是折疊區(qū)尾部結(jié)構(gòu)，一邊是線性區(qū)域，而且該小分子與蛋白的其他部分無(wú)接觸。因此，設(shè)計(jì)免疫原主要以線性表位為主，同時(shí)根據(jù)折疊區(qū)和線性表位的距離，設(shè)計(jì)T細(xì)胞表位的多肽。

同時(shí)，有些蛋白有原始形態(tài)和剪切體，針對(duì)這類抗體設(shè)計(jì)免疫原，需根據(jù)最終需要檢測(cè)的目的片段進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以設(shè)計(jì)同時(shí)識(shí)別剪切體和全長(zhǎng)，也可設(shè)計(jì)只識(shí)別全長(zhǎng)，這類抗體有時(shí)可以用于檢測(cè)血清的游離分子的殘存。

總結(jié)

綜上所述，制備免疫原的方法較多，但根據(jù)抗體的最終用途，免疫原的設(shè)計(jì)策略各有不同。如何能做到事半功倍，前期需要對(duì)靶標(biāo)有充分的認(rèn)識(shí)，選擇合理的片段進(jìn)行制備，才能得到我們所需的抗體。

 

以上就是華安生物進(jìn)行免疫原設(shè)計(jì)的一些淺顯經(jīng)驗(yàn)，希望能給正在研究的小伙伴們帶來(lái)幫助，有需要的童鞋記得收藏哦~

文章中部分圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)
 

 

華安生物

杭州華安生物技術(shù)有限公司成立于2007年3月，總部位于中國(guó)杭州，是一家從事抗體研發(fā)與生產(chǎn)的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)。公司致力于為全球的科研工作者和工業(yè)客戶提供高品質(zhì)的抗體試劑及抗體定制服務(wù)，生產(chǎn)體系通過(guò)ISO9001國(guó)際質(zhì)量體系認(rèn)證。公司的產(chǎn)品線包括兔單抗、小鼠單抗、兔多抗、羊駝抗體、二抗、蛋白/多肽、抗體檢測(cè)用相關(guān)試劑等11000余種。2015年，公司開(kāi)始專注于高通量重組兔單克隆抗體的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)，公司也為客戶提供定制抗體的開(kāi)發(fā)、純化和篩選服務(wù)。

迄今為止，公司已為各個(gè)領(lǐng)域完成 3000個(gè)定制科研抗體項(xiàng)目，為工業(yè)級(jí)客戶開(kāi)發(fā)IVD診斷用腫瘤標(biāo)志物系列抗體原料和食品安全檢測(cè)相關(guān)抗體百余種，為制藥公司提供包括PD1和PD-L1熱門(mén)靶點(diǎn)在內(nèi)的早期抗體藥物篩選十余種。 

 

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