文章導(dǎo)讀

2020年3月20日，云序客戶上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院田聆教授課題組在高分期刊Moleular Cancer雜志（影響因子10.679）發(fā)表了關(guān)于外泌體在胰腺癌腫瘤再生長(zhǎng)中的研究。腫瘤再生長(zhǎng)是放射治療失敗的主要原因。以往的研究表明，死亡的腫瘤細(xì)胞通過促進(jìn)殘留的腫瘤再生細(xì)胞(TrCs)的增殖，在腫瘤再增殖過程中起著至關(guān)重要的作用。然而，TRCs在放療后也會(huì)遭受DNA損傷，并可能在垂死細(xì)胞釋放的增殖因子的刺激下發(fā)生有絲分裂錯(cuò)誤。因此，本研究打算找出這些自相矛盾的生物學(xué)過程是如何發(fā)生的，以降低放療后腫瘤的再增殖可能。接下來，小編就帶大家一起解讀這篇高分文章。

發(fā)表期刊：Mol. Cancer
影響因子：10.679
發(fā)表日期：20200320
實(shí)驗(yàn)方法：全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、外泌體miRNA測(cè)序（云序提供測(cè)序服務(wù)）
文獻(xiàn)鏈接：Dying tumor cell-derived exosomal miR-194-5p potentiates survival and repopulation of tumor repopulating cells upon radiotherapy in pancreatic cancer

 文章內(nèi)容
（1）受輻射的垂死腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體可動(dòng)態(tài)增強(qiáng)腫瘤的繁殖
首先作者通過相關(guān)研究證明受輻射的垂死腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體在輻射后期會(huì)促進(jìn)增殖。為了弄清原理，作者對(duì)輻射前后的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（本實(shí)驗(yàn)云序提供）。并進(jìn)行了GO分析，發(fā)現(xiàn)差異基因多富集在與細(xì)胞外囊泡和外泌體調(diào)控有關(guān)的條目中（圖1a）。接著作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與未輻照的胰腺癌細(xì)胞相比，輻照過的胰腺癌細(xì)胞的外泌體釋放量增加（圖1b）。為了驗(yàn)證外泌體在存活的腫瘤細(xì)胞中的直接作用，作者在體外進(jìn)行了菌落形成試驗(yàn)。放射后，用垂死的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體處理的癌細(xì)胞的集落形成能力顯著增強(qiáng)（圖1g）。結(jié)果表明，來自垂死的腫瘤細(xì)胞的外泌體可以促進(jìn)放射后的細(xì)胞存活。
作者進(jìn)一步探討了外泌體對(duì)胰腺癌的作用，作者在胰腺癌異種移植（PDX）小鼠模型中進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)輻照的PDX腫瘤能加速種群重現(xiàn)（圖1h）。當(dāng)PDX小鼠同時(shí)用GW4869（外泌體抑制劑）治療時(shí)，腫瘤的種群顯著減慢（圖1h），小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng)了（圖1i）。這些結(jié)果表明，垂死的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)了腫瘤的重新聚集。

（2）垂死的腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體增強(qiáng)了ALDH1A1+ TRC的存活
作者認(rèn)為腫瘤再生細(xì)胞（TRC）可能是外泌體的主要受體。由于目前沒有辦法鑒定TRC，因此作者收集了放射后存活的胰腺癌細(xì)胞，并通過高通量測(cè)序分析了癌癥干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)與未輻射的對(duì)照組相比，有62個(gè)基因表達(dá)被上調(diào)， 值得注意的是，輻射后ALDH1A1的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2a）。眾所周知，ALDH1A1是胰腺癌干樣細(xì)胞重要的標(biāo)志物之一。ALDEFLOUR™實(shí)驗(yàn)表明，放射后存活的癌細(xì)胞和原發(fā)性胰腺腫瘤細(xì)胞中ALDH +細(xì)胞的比例顯著提高（圖2b-c）。qPCR分析和Western印跡表明，ALDH1A1的表達(dá)在受輻照的胰腺癌細(xì)胞和PDX腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)（圖2d）。免疫組織化學(xué)（IHC）染色進(jìn)一步顯示，ALDH1A1+細(xì)胞在PDX腫瘤組織中照射后高度富集（圖2e）。但是，GW4869顯著抑制了ALDH1A1+細(xì)胞的積累（圖2e），這表明外泌體可能會(huì)促進(jìn)ALDH1A1 +細(xì)胞的存活。
此外，作者檢查了垂死的腫瘤細(xì)胞對(duì)TRC的直接保護(hù)作用。當(dāng)與受輻照的胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，受輻照的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯更高的存活率（圖2g-h）。如圖所示，輻射細(xì)胞分離的外泌體顯著提高了細(xì)胞的存活率（圖2h）。以上結(jié)果表明，在放療中垂死腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體能提高ALDH1A1+ TRC的存活率。

（3）外泌體通過促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)增強(qiáng)TRC的存活
接著，作者探討了垂死的腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體如何促進(jìn)ALDH1A1+細(xì)胞的存活。H＆E染色顯示，PDX腫瘤中的細(xì)胞在放射后14天呈現(xiàn)出較大的核，并具有明顯的異質(zhì)性（圖3a），這表明了放射損傷的積累。輻射后50天，細(xì)胞恢復(fù)了活力，并恢復(fù)了“正常”的細(xì)胞核形態(tài)。但是，GW4869處理后阻礙了腫瘤細(xì)胞的恢復(fù)（圖3a）。值得注意的是，ALDH1A1+和γH2A.X雙重染色表明，輻射后，ALDH1A1+細(xì)胞也遭受了DNA損傷（圖3b）。在GW4869治療組中，大多數(shù)ALDH1A1+細(xì)胞在放射后50天仍顯示出明顯的γH2A.X陽性灶（圖3b）。這些數(shù)據(jù)表明，輻射后TRC的存活涉及DNA損傷反應(yīng)（DDR），該損傷由受輻射的垂死腫瘤細(xì)胞的外泌體調(diào)節(jié)。
此外，作者還探究了外泌體是否能直接促進(jìn)體外輻射存活TRC的DDR。如示蹤細(xì)胞所示，輻射在ALDH1A1+和ALDH1A1-細(xì)胞中均引起DNA損傷（圖3c）。GW4869顯著損害了ALDH1A1+細(xì)胞的修復(fù)，因?yàn)樗鼈冎械拇蠖鄶?shù)在放射后3天仍攜帶γH2A.X陽性灶（圖3c）。此外，來自輻射的垂死腫瘤細(xì)胞的外泌體顯著加速了γ-H2A.X和pATM的衰減（圖3d）并降低了輻射細(xì)胞中DNA損傷（圖3e）�？傮w而言，這些結(jié)果表明，受輻射的垂死的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體通過促進(jìn)DDR增強(qiáng)了TRC的存活。

（4）外泌體miR-194-5p促進(jìn)受損TRC的修復(fù)
作為外泌體的重要內(nèi)含物，作者推斷miRNAs可能在TRC的存活中起重要作用。因此，作者進(jìn)行了對(duì)輻射前后的腫瘤細(xì)胞外泌體進(jìn)行了外泌體miRNA測(cè)序（本實(shí)驗(yàn)云序提供），發(fā)現(xiàn)在垂死的腫瘤細(xì)胞來源的外泌體中，兩個(gè)重要的miRNA，即miR-196b-5p和miR 194-5p顯著上調(diào)（圖4a）。前人研究表明，miR-194可能參與基因組穩(wěn)定性。因此，作者將其作為目標(biāo)分子，通過qPCR分析驗(yàn)證了miR-194-5p在外泌體中的高表達(dá)（圖4b）。同樣，miR-194-5p mimics轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在輻射后具有更強(qiáng)大的集落形成能力（圖4d）。此外，當(dāng)使用強(qiáng)力霉素處理時(shí)，胰腺癌細(xì)胞的集落形成被顯著抑制。但是，如果強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后的胰腺癌細(xì)胞暴露于輻射中，則這些細(xì)胞的集落形成將顯著增強(qiáng)（圖4e）。此外，miR-194-5p mimics在輻射的胰腺癌細(xì)胞中顯著促進(jìn)了γH2A.X和pATM的衰減（圖4f）和DNA損傷的減少。這些結(jié)果表明，外泌體miR-194-5p通過促進(jìn)DDR促進(jìn)了TRC的存活。
為了進(jìn)一步確定miR-194-5p的主要有效靶標(biāo)，作者首先預(yù)測(cè)了它的靶基因，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行KEGG分析，預(yù)測(cè)目標(biāo)中只有轉(zhuǎn)錄因子E2F3與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。E2F3是E2F家族的一員，已被廣泛發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。于是作者用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)證明E2F3是miR-194-5p的直接靶標(biāo)（圖4g）。與miR-194-5p相反，E2F3過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程和EdU摻入，并阻礙pATM和γH2A.X的衰減（圖4h）并減少受輻照的胰腺癌細(xì)胞中DNA的損傷。E2F3基因敲除提高了放射后胰腺癌細(xì)胞的集落形成能力，而miR-194-5p mimics的轉(zhuǎn)染并沒有進(jìn)一步增強(qiáng)該能力（圖4i）。這些數(shù)據(jù)表明外泌體miR-194-5p抑制E2F3誘導(dǎo)G1 / S阻滯并促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。
先前的研究確定HMGA2和E2F3是胰腺癌的八個(gè)主要調(diào)節(jié)樞紐中的兩個(gè)，  作者發(fā)現(xiàn)HMGA2負(fù)調(diào)控miR-194-5p的表達(dá)（圖4j），并通過一系列實(shí)驗(yàn)證明，HMGA2富含莖狀A(yù)LDH1A1+細(xì)胞，并且有助于胰腺癌的進(jìn)展。但是，當(dāng)胰腺癌細(xì)胞暴露于10Gy輻射時(shí)，HMGA2的過表達(dá)顯著抑制了這些細(xì)胞的集落形成能力（圖4k），而敲除HMGA2則增強(qiáng)了細(xì)胞存活和集落形成（圖4l）。HMGA2還阻礙了輻射的胰腺癌細(xì)胞中pATM和γH2A.X的衰減（圖4m）和DNA損傷�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明，TRC中富集的HMGA2促進(jìn)了干細(xì)胞的生長(zhǎng)和癌癥進(jìn)展，但潛在地?fù)p害了輻射的TRC的存活和恢復(fù)，而來自垂死的腫瘤細(xì)胞的外泌體miR-194-5p瞬時(shí)逆轉(zhuǎn)了輻射下HMGA2的作用。

（5）垂死的腫瘤細(xì)胞釋放的PGE2促進(jìn)TRC的增殖
如前所述，垂死的腫瘤細(xì)胞能促進(jìn)報(bào)告細(xì)胞的增殖，這暗示著TRCs被除了外泌體miR-194以外的物質(zhì)驅(qū)使加速了增殖。眾所周知，受輻射的垂死腫瘤細(xì)胞還釋放了PGE2，這是一種脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是化學(xué)放療后腫瘤重生的重要介質(zhì)。因此，作者通過ELISA定量了受輻射的垂死胰腺癌細(xì)胞中的PGE2，發(fā)現(xiàn)放射后24小時(shí)PGE2含量保持不變，但在48小時(shí)略有升高，而在72小時(shí)顯著增加（圖5a）。
同樣，PGE2形成的關(guān)鍵酶PTGS2（COX-2）的表達(dá)也經(jīng)歷了短暫的滯后階段，之后逐漸增加（圖5b-c）。而輻射后，胰腺癌細(xì)胞中，外泌體相關(guān)蛋白（如RAB27A，TSG101和CD9）的表達(dá)立即增加（圖5c）。值得注意的是，當(dāng)COX-2的表達(dá)逐漸增加時(shí)，外泌體相關(guān)蛋白的表達(dá)減少（圖5c）。在PDX小鼠模型中，IHC染色還顯示，放射后不久，外泌體相關(guān)蛋白的表達(dá)升高，直到12天后下降，此時(shí)COX 2的表達(dá)開始顯著上調(diào)（圖5d）。
同時(shí)，發(fā)現(xiàn) celecoxib（一種抑制PGE2合成的COX-2抑制劑）以劑量依賴性方式顯著抑制了腫瘤細(xì)胞的繁殖（圖5e）。雖然PGE2可以加速腫瘤細(xì)胞的增殖，但是在放射后立即向腫瘤細(xì)胞中添加PGE2會(huì)反向抑制細(xì)胞活力（圖5f）。值得注意的是，celecoxib處理并不會(huì)影響外泌體相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖5g）。這些結(jié)果表明，輻射的垂死腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)于腫瘤的再形成至關(guān)重要。
綜上，這些結(jié)果表明，垂死的腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體和PGE2共同作用導(dǎo)致了腫瘤的再增殖級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中外泌體miR-194-5p首先抑制細(xì)胞增殖以促進(jìn)TRC的恢復(fù)，然后PGE2促進(jìn)TRC的加速增殖。

（6）阿司匹林通過削弱垂死的腫瘤細(xì)胞的分泌物來抑制放療后的腫瘤
作者前期研究推測(cè)，阿司匹林可能具有抑制胰腺癌中腫瘤再增殖的潛力，前人研究也表名其會(huì)影響外泌體和miRNA。因此，作者首先在體外測(cè)試了阿司匹林治療在腫瘤細(xì)胞重塑模型中的作用。發(fā)現(xiàn)阿司匹林極大地抑制了與輻射的垂死腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的報(bào)告細(xì)胞的增殖（圖6a），而當(dāng)它們單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)對(duì)報(bào)告細(xì)胞的增殖沒有影響。阿司匹林降低了輻射的胰腺癌細(xì)胞上清液中的PGE2含量（圖6b），并減少了細(xì)胞釋放的外泌體的量（圖6c）。此外，在阿司匹林處理過的輻射細(xì)胞衍生的外泌體中，miR-194-5p被下調(diào)（圖6d）。與僅接受放射線處理的細(xì)胞分泌的外泌體相比，經(jīng)阿司匹林處理的輻射細(xì)胞衍生的外泌體喪失了誘導(dǎo)G1 / S阻滯并減少EdU摻入的能力（圖6e-f）。因此，經(jīng)阿司匹林處理的輻射細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在輻射后不能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的集落形成（圖6g）。
接著，作者又在PDX小鼠模型中測(cè)試了阿司匹林治療的效果。阿司匹林單一療法對(duì)PDX腫瘤無治療作用，單獨(dú)放療同樣無治療作用（圖6h-i）。然而，阿司匹林治療和放射療法的結(jié)合顯著抑制了腫瘤的重新聚集并延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的存活時(shí)間（圖6h-i）。此外，阿司匹林損害了放療后腫瘤組織的恢復(fù)，這與GW4869的作用相似。同時(shí)，阿司匹林還抑制了放療后腫瘤組織中ALDH1A1+ TRC的富集。這些數(shù)據(jù)表明，阿司匹林可抑制胰腺癌放療后的腫瘤再增殖。

總結(jié)

總的來說，本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（云序提供）和外泌體miRNA測(cè)序（云序提供），鑒定顯著變化的miRNAs。并采用qPCR、Western blot、IHC、FACS、集落形成等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分子和細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)垂死腫瘤細(xì)胞來源的外泌體通過傳遞miR-194-5p誘導(dǎo)G1/S期阻滯，促進(jìn)DNA損傷反應(yīng)，提高TRCs的存活率，進(jìn)而調(diào)節(jié)E2F3的表達(dá)。此外，外泌體miR-194-5P可減輕放療時(shí)致癌HMGA2的毒副作用。在潛伏一段時(shí)間后，垂死的腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步釋放大量的PGE2來恢復(fù)TRCs的增殖，并協(xié)調(diào)了再增殖的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)小劑量阿司匹林可以通過抑制外泌體和PGE2的分泌來抑制胰腺癌放療后的再生長(zhǎng)。

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