一、外泌體研究熱度持續(xù)攀升

外泌體（exosome）是活細(xì)胞分泌的30-200nm的囊泡，在電鏡下具有非常明顯單層膜結(jié)構(gòu)，通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形。其主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，它們廣泛存在于血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁等體液中，被視為特異性分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊。
有關(guān)外泌體分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應(yīng)功能的精確分子機制近些年剛剛開始受到關(guān)注，與外泌體相關(guān)的被pubmed收錄的文章數(shù)量和國自然基金項目中標(biāo)數(shù)量逐年增長，表明國內(nèi)外對外泌體的研究興趣日益增長（圖1）。
 

圖1. 外泌體文章發(fā)表數(shù)目和國自然基金立項數(shù)目
 

 從圖1可以看到2019年國家自然科學(xué)基金獲批項目中，外泌體研究相關(guān)項目總數(shù)500多，比2018年增加了70多項，而下面圖2則顯示2019年外泌體立項總金額突破2億元，比2018年高4000多萬元！從這個趨勢來看，外泌體國自然立項必將持續(xù)走高，外泌體的研究仍大有可為！

 那么，2019年獲批的外泌體研究項目都集中在哪些領(lǐng)域，或者說研究方向呢？

1.外泌體項目獲批學(xué)科方向
從統(tǒng)計來看，與前年相似外泌體立項最集中的領(lǐng)域還是腫瘤學(xué) （圖3），近年來外泌體發(fā)表的文章也絕大部分與其在腫瘤的形成，耐藥性，檢測等方面有關(guān)。例如2019年發(fā)表在Molecular Cancer （IF=10.679）上的文章表明外泌體FMR1-AS1通過TLR7/NFκB/c-My信號通路在女性食管癌中促進維持癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞的動態(tài)平衡。發(fā)表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=5.646）上的一篇文章發(fā)現(xiàn)外泌體轉(zhuǎn)運p-STAT3可促進結(jié)直腸癌細(xì)胞獲得性5-FU耐藥性。發(fā)表在Cancers(IF=6.162)上的一篇文章則研究了腹腔灌洗液中細(xì)胞外囊泡相關(guān)的miRNA作為子宮內(nèi)膜癌分子標(biāo)志物的可能性。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)和精神疾病，中醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域也有不少外泌體相關(guān)項目中標(biāo)。

 

 2.外泌體獲批項目中的熱點分子

由于外泌體的主要功能被認(rèn)為是細(xì)胞之間的信息傳遞，了解它帶有的蛋白質(zhì)和多種RNA上的信息就變得尤其重要。2019年外泌體中標(biāo)項目中帶有熱門話題miRNA、lncRNA和環(huán)狀RNA的項目數(shù)量如下圖（圖4）所示。我們可以看到，外泌體中的miRNA和lncRNA過去研究的是比較多了，例如發(fā)表在Hepatology（IF=14.971）上的一篇文章表明肝癌細(xì)胞釋放的外泌體miRNA調(diào)控巨噬細(xì)胞程序性死亡配體1的表達。另一篇文章發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞來源的外泌體LncRNA H19促進肝星狀細(xì)胞活化和膽汁淤積性肝纖維化。相對的，外泌體中的circRNA研究目前還較少，而circRNA分子自身獨特的穩(wěn)定性、組織特異性、時序和疾病特異性等，使它很有可能成為外泌體檢測的下一個熱門分子。
 

3.外泌體項目中標(biāo)金額

最后，表1列舉了2019年外泌體基金中標(biāo)金額前5的項目，可以看到外泌體的研究開始與應(yīng)用聯(lián)系起來，與2018年項目金額前10的全部是分子機制的研究相比，2019年關(guān)于外泌體臨床應(yīng)用的項目也能躋身前五。所有中標(biāo)項目中，項目類型依然十分廣泛，從重點重大項目到青年科學(xué)項目均有外泌體相關(guān)研究。

項目	單位	金額
腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的內(nèi)驅(qū)力與外泌體	浙江大學(xué)	400萬
特異性外泌體的功能機制及其作為新型腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌精準(zhǔn)檢驗中的應(yīng)用研究	上海交通大學(xué)	295萬
外泌體活性依賴性釋放和腦膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)損傷介導(dǎo)慢性內(nèi)臟痛的脊髓神經(jīng)環(huán)路機制研究	蘇州大學(xué)	248萬
瓦斯爆炸肺損傷分子機制及間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體修復(fù)作用研究	新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院	218萬
神經(jīng)干細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體在介導(dǎo)衰老與神經(jīng)退行性病變中的作 用及其分子機制研究	同濟大學(xué)	205萬

值得一提的，近年關(guān)于外泌體在液體活檢中的應(yīng)用有不少文章發(fā)表，例如發(fā)表在Journal of Cellular Physiology (IF=4.521)上的文章表明腫瘤來源外泌體lncRNA Exo-GAS5可能成為基于血清的鑒定早期非小細(xì)胞癌的分子標(biāo)志物。發(fā)表在Journal of cellular and molecular medicine (IF=4.658)則顯示尿液外泌體miRNA可能成為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的分子標(biāo)志物。

介紹了這么多外泌體項目中標(biāo)情況，接下來我們看看外泌體的研究思路是怎樣的呢？

二、外泌體研究思路

外泌體研究通常與高通量測序的聯(lián)系最為緊密，研究思路可以分為三大類：表達譜、分子標(biāo)志物和分子機制方向，其中表達譜思路的特點就是短平快、通常以測序數(shù)據(jù)為主要內(nèi)容，短平快發(fā)表3-5分文章。而分子標(biāo)志物的特點是在表達譜基礎(chǔ)之上加入大量樣本驗證，建立ROC、KM曲線，分析分子與臨床疾病的相關(guān)性為主，通常文章影響因子在3-10分之間。最后是分子機制研究，顧名思義要做到細(xì)胞功能、機制研究深度，因此工作量通常較大，影響因子通常能夠上10+。接下來我們就來詳細(xì)介紹一下這三種思路的具體案例。

1．表達譜

表達譜思路案例1（云序客戶）

云序客戶2018年發(fā)表在Journal of Neurotrauma (IF=5.190) 上的Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice，是天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院張建寧教授帶領(lǐng)的神經(jīng)創(chuàng)傷團隊針對大腦創(chuàng)傷的研究。下圖為大家整理了文章的研究思路。
 

作者通過對小鼠腦周質(zhì)外泌體的全轉(zhuǎn)錄組測序（本實驗云序提供）檢測到環(huán)狀RNA的表達變化。通過生信分析如GO及KEGG分析對外泌體差異表達的環(huán)狀RNA進行了功能預(yù)測。GO分析表明這些RNA分子主要參與神經(jīng)損傷修復(fù)，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)信號傳導(dǎo)相關(guān)，這些分子同時主要富集在cGMP-PKG信號通路。而環(huán)狀RNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)圖揭示了環(huán)狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。這篇文章研究了大腦創(chuàng)傷外泌體中環(huán)狀RNA變化，為后續(xù)分子機理詳細(xì)研究提供諸多靶分子，也為大腦創(chuàng)傷的干預(yù)治療提供潛在的靶點。
 

 

表達譜思路案例2 （云序客戶）


云序客戶2019年發(fā)表在Journal of Cellular Biochemistry (IF=3.448)上的Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early‐stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers, 研究思路如下圖所示：

 

作者通過對5個肺腺癌（LUAD）患者和5個健康人血漿外泌體的環(huán)狀RNA測序（本實驗云序提供），找出了105個上調(diào)和77個下調(diào)環(huán)狀RNA。然后在15個患者和15個健康人的血漿中通過qPCR確認(rèn)到其中4個表達顯著上調(diào)。最后通過circRNA‐miRNA‐mRNA 相互作用網(wǎng)絡(luò)推測了這4個circRNA可能吸附的miRNA和它們可能的靶基因。
 

 

2．分子標(biāo)志物

分子標(biāo)志物思路案例1

外泌體分子標(biāo)志物的研究是在表達譜的基礎(chǔ)上進行更進一步的分析和篩選，并且通過擴大樣本驗證，來確認(rèn)可以作為標(biāo)志物的分子。這類研究與臨床應(yīng)用聯(lián)系更緊密，近年來越來越受重視。2019年發(fā)表在Molecular Cancer（IF=10.679）上的文章Tumor-originated exosomal lncUEGC1 as a circulating biomarker for early-stage gastric cancer， 文章思路如下圖：
 

 

作者分別從健康人（HC）和胃癌患者(GC)的血漿，培養(yǎng)的人胃上皮細(xì)胞(HPSEC)和胃癌細(xì)胞(GCC)中提取外泌體進行了鑒定，然后通過對lncRNA測序（云序提供此項服務(wù)），從差異外泌體中篩選出了lncUEGC1并用qPCR進行了驗證。最后，再擴大了樣本檢測, 通過ROC曲線分析證明了lncUEGC1有希望作為高效穩(wěn)定的早期胃癌的分子標(biāo)志物。
 

 

分子標(biāo)志物思路案例2

發(fā)表在Clin Cancer Res （IF=10.199）上的Evaluation of tumor-derived exosomal miRNA as potential diagnostic biomarkers for early stage non-small-cell lung cancer using next-generation sequencing，其文章研究思路如下圖：

 

作者對46名非小細(xì)胞肺癌I期患者（其中惡性腺瘤26人，鱗狀細(xì)胞癌20人）和健康人血漿中的外泌體進行提取和鑒定，通過miRNA-seq （云序提供此項服務(wù)）和qPCR，篩選并驗證了4個只在惡性腺瘤外泌體中表達改變的miRNA，3個只在鱗狀細(xì)胞癌外泌體中表達改變的miRNA，以及4個在兩種細(xì)胞的外泌體中都表達改變的miRNA。最后擴大樣本，在60個患者中檢測驗證了患者體內(nèi)miRNA組合與疾病診斷的準(zhǔn)確性。這項研究篩選出了有望成為高敏感度、非侵入性檢驗早期非小細(xì)胞肺癌的分子標(biāo)志物的外泌體miRNA。

3．分子機制

由于外泌體重要功能是細(xì)胞間的交流，其內(nèi)攜帶的分子又種類繁多，研究揭示的外泌體影響的生物功能也是十分廣泛，涉及到哺乳動物的生殖和發(fā)育，免疫系統(tǒng)和感染，代謝和心血管疾病，神經(jīng)退行性變以及癌癥腫瘤。研究外泌體在這些過程中的作用影響，以及經(jīng)過哪些具體的通路，發(fā)表文章的周期會較長，但是相對的，影響因子也高，很多都在10分以上。
分子機制案例
2020年發(fā)表在The Journal of Clinical Investigation （IF=12.282）上的Exosomal long noncoding RNA LNMAT2 promotes lymphatic metastasis in bladder cancer， 揭示了外泌體lncRNA介導(dǎo)的淋巴轉(zhuǎn)移機制，并將LNMAT2作為膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移的治療靶點。下面我們來看一下文章的研究思路：

 

作者首先通過LncRNA-seq（云序提供此項服務(wù)）篩選了在淋巴轉(zhuǎn)移的膀胱癌中上調(diào)的LNMAT2，并驗證了LNMAT2過表達使膀胱癌病人生存率降低。然后，原位雜交實驗將LNMAT2與膀胱癌外泌體聯(lián)系在一起，并通過提取鑒定外泌和qPCR進行了確認(rèn)。接著，通過體外共孵育和體內(nèi)實驗證明了上調(diào)LNMAT2能促進淋巴生成。最后為了探究LNMAT2作用的分子機制，巧妙利用了RNA pull -down+MS/WB、RIP、ChIP以及雙熒光素酶報告實驗等方法，發(fā)現(xiàn)并證實了hnRNPA2B1介導(dǎo)LNMAT2進入膀胱癌外泌體中，外泌體LNMAT2被人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞攝取內(nèi)化后，通過募集hnRNPA2B1和增加PROX1啟動子上的H3K4三甲基化水平，進一步上調(diào)PROX1表達，最終導(dǎo)致淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。

 

三、云序提供全轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)

1.一站式服務(wù)：
客戶只需提供體液樣本，云序生物為您完成從外泌體提取、外泌體鑒定、外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序、RIP、RNA pull-down、雙熒光素酶報告實驗到數(shù)據(jù)分析整套服務(wù)流程。

 

2.全面的檢測類型的RNA

 

 

3.豐富的微量測序經(jīng)驗

云序生物作為以高通量測序技術(shù)為依托的科研服務(wù)公司，擁有豐富的微量樣本測序經(jīng)驗，為眾多臨床與基礎(chǔ)科研研究者提供了高質(zhì)量的科研服務(wù)，助力客戶發(fā)表過眾多微量樣本的SCI文章，其中包含多篇外泌體文章。
 

雜志	標(biāo)題
J. C.Inv IF=13.251	Platelet-derived miR-223 promotes a phenotypic switch in arterial injury repair
Nat. C. IF=12.35	MicroRNA-27a controls the intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis by regulating calciumassociated autophagy
Haematologica IF=7.7	Histone modifier gene mutations in peripheral T-cell lymphoma not otherwise specified
Mol. N. Acids IF=5.92	Circular RNA Expression Profiling and the Potential Role of hsa_circ_0089172 in Hashimoto’s Thyroiditis via Sponging miR125a-3p
Aging IF=5.515	Hematoma-derived exosomes of chronic subdural hematoma promote abnormal angiogenesis and inhibit hematoma absorption through miR-144-5p
J. Neurotrauma IF=5.19	circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice
Epigenomics IF=4.404	CircRNA hsa_circ_0004771 promotes esophageal squamous cell cancer progression via miR-339-5p/CDC25A axis.
Bio.P. IF=3.74	Small RNA-sequencing identified the potential roles of neuron differentiation and MAPK signaling pathway in dilated cardiomyopathy
J. Cell. Bi. IF=3.448	Circular RNAs expression profiles in plasma exosomes from early-stage lung adenocarcinoma and the potential biomarkers
Gene IF=2.638	Profiling and bioinformatics analyses reveal differential circular RNA expression in ovarian cancer.
Evid B.C.A.M IF=1.98	Determination of Electroacupuncture Effects on circRNAs in Plasma Exosomes in Diabetic Mice: An RNA-Sequencing Approach
Mol M. R. IF=1.85	RNA sequencing discloses the genomewide profile of long noncoding RNAs in dilated cardiomyopathy
Mol M. R. IF=1.692	Upregulation of long noncoding RNA AP003419.16 predicts high risk of agingassociated idiopathic pulmonary fibrosis

云序疫情期間針對外泌體的講座視頻已經(jīng)全部錄好，對外泌體感興趣的老師可以點擊以下鏈接：

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外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序
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