DNA甲基化修飾是表觀遺傳研究的熱點之一，我們通常認(rèn)為DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），卻不知道隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，科研者們已經(jīng)在真核生物中（果蠅 、真菌、萊茵衣藻、秀麗隱桿線蟲等）發(fā)現(xiàn)了一種新的DNA甲基化修飾—DNA-6mA甲基化，且DNA-6mA甲基化能影響基因表達(dá)，在動植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，同時與包括癌癥在內(nèi)的多種人類疾病密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)成功地掀起了科學(xué)家們對DNA-6mA的研究熱潮，使DNA-6mA成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點中的熱點。接下來就以幾篇經(jīng)典案例為大家介紹DNA-6mA。

DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958
作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三種技術(shù)相結(jié)合的方法研究小鼠基因組甲基化。研究發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞中存在另一種DNA甲基化修飾—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修飾的一種去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突變小鼠細(xì)胞中腺嘌呤甲基化水平增加，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默。揭示了哺乳動物表觀修飾的重要組成部分—6mA甲基化，在哺乳動物中發(fā)揮沉默基因表達(dá)的功能，而不是如其他生物體中激活基因表達(dá)的作用。

   

                                      6mA分析                                     6mA與基因表達(dá)的關(guān)系

6mA-IP seq分析

N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398
作者以果蠅胚胎干細(xì)胞為材料，對其基因組中6mA修飾進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在果蠅基因組中6mA修飾廣泛存在，這種修飾受內(nèi)源去甲基化酶DMAD調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中呈動態(tài)變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DMAD酶作為果蠅胚胎發(fā)育所必須的一種酶，它作用于轉(zhuǎn)座子的6mA位點，去甲基化后，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)受到抑制。該文章發(fā)現(xiàn)果蠅中DNA甲基化修飾新類型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的調(diào)控機(jī)制。

  

              6mA分布                                       mA體外去甲基化分析

6mA-IP seq與RNA-seq聯(lián)合分析

N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas. Cell, IF: 31.398
文章利用三項6mA研究技術(shù)：6mA-IP-Seq、6mA-CLIP-Exo、6mA-RE-Seq對果蠅基因組和衣藻基因組中的6mA修飾進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在果蠅基因組中84%的基因穩(wěn)定的存在6mA修飾。且6mA主要以雙峰形式分布在TSS區(qū)域，與核小體分布相關(guān)，呈周期性分布。進(jìn)一步結(jié)合RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)，6mA與基因表達(dá)有緊密關(guān)系。而衣藻的基因組中的6mA甲基化修飾又有新的特點，6mA修飾主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域，以雙峰形式分布。其主要序列特征為C6mATG和G6mATC。接著通過對RNA-seq檢測到的高表達(dá)基因和低表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因的TSS附近的6mA富集程度較高，而低表達(dá)基因的TSS附近的6mA富集程度較低，與5mC的分布特點相反。通過這些數(shù)據(jù)說明真核生物中的6mA修飾能夠調(diào)控基因表達(dá)。

6mA的分布特征                                               motif分析

 peak分析

N6-Methyladenine DNA Modification in the Human Genome.Molecular Cell，IF: 14.248
RNA-6mA在前期的研究中已被證實對基因表達(dá)有重要的影響，但是對于DNA-6mA在基因表達(dá)方面的相關(guān)作用，研究并不是很清楚。而本篇文章作者首先利用6mA-IP-seq技術(shù)，通過對DNA -6mA修飾圖譜分析發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)水平基因的外顯子區(qū)域具有較高的6mA豐度，并且與RNA表達(dá)水平正相關(guān)；6mA修飾位點在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)相關(guān)基因中有顯著的富集，預(yù)測了6mA甲基化在GPCR相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用。接著通過6mA-IP-qPCR、ALKBH1基因和N6AMT1基因的敲除和過表達(dá)等實驗，闡述了DNA-6mA甲基化的調(diào)控機(jī)制�？偟膩碚f，本篇文章的意義在于：首次破譯人類DNA  N6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜，揭示了DNA-6mA甲基化修飾在人類基因組中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能。

DNA-6mA相關(guān)分析

云序生物 - 6mA-IP -seq一站式服務(wù)
云序生物率先開發(fā)了DNA-6mA測序技術(shù)—。其原理類似于MeDIP的免疫共沉淀測序技術(shù)，利用特異性抗體富集6mA片段，擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序及甲基化分析，以較小的數(shù)據(jù)量，快速、高效地繪制全基因組DNA甲基化水平的圖譜。

一站式服務(wù)：
客戶只需提供相關(guān)樣品的基因組DNA，云序生物為您完成從6mA-IP富集，文庫制備，上機(jī)測序到數(shù)據(jù)分析整套服務(wù)流程。
優(yōu)化的實驗流程：
6mA-IP的富集效率是決定數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵，云序生物6mA-IP實驗采用預(yù)驗證的商業(yè)化抗體和精心優(yōu)化的實驗流程，具有極高的效率和特異性。
嚴(yán)格的質(zhì)控：
實驗的各個關(guān)鍵步驟進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控，全程監(jiān)控實驗質(zhì)量，確�？蛻舻玫絻�(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)。
專業(yè)的生物信息學(xué)分析：
云序生物具有強(qiáng)大的生物信息學(xué)團(tuán)隊，能夠滿足客戶的各類深入數(shù)據(jù)分析需求。
2、樣本要求
樣品類型：無降解且無RNA污染的DNA樣品(適用所有有參考基因組的物種)。
樣品需求量：不少于10ug
樣品濃度：不少于50ng/ul
樣品運輸及保存：
樣品運輸：樣品置于1.5mL Eppendorf 管中，封口膜封好，干冰運輸，DNA可用冰袋運輸。
樣品保存：細(xì)胞樣品或新鮮組織塊切塊，液氮凍存后-80℃保存；DNA樣品短期內(nèi)可-20℃，避免反復(fù)凍融。
3、數(shù)據(jù)分析
標(biāo)準(zhǔn)分析：
（1）DNA甲基化富集峰的識別
通過高通量測序和生物信息分析，識別甲基化富集的基因組區(qū)域，默認(rèn)p <= 1e-5（具體參數(shù)以報告為準(zhǔn)，云序生物會根據(jù)數(shù)據(jù)，適當(dāng)調(diào)整參數(shù)）的峰為統(tǒng)計上顯著的甲基化區(qū)。
注：每個樣品組做一個Input，以去除基因組背景，降低假陽性率。

（2）DNA甲基化區(qū)域富集峰的注釋
富集峰識別后，得到的是一堆基因組位置信息，通過生物信息分析利用最鄰近基因?qū)Ω患�峰進(jìn)行注釋，并根據(jù)峰中點相對于已知基因的位置，將富集峰為啟動子峰、上游峰、內(nèi)含子峰、外顯子峰、基因間峰。

 

（4）差異DNA甲基化區(qū)域的鑒定（DMRs）與注釋
云序生物使用diffReps軟件進(jìn)行差異甲基化區(qū)（differentially methylated regions，DMRs）鑒定。默認(rèn)p-value<0.0001，fold change >=2作為差異甲基化區(qū)的閾值。

（5）差異DNA甲基化區(qū)的GO（Gene Ontology）與信號通路分析
目的：對差異甲基化基因進(jìn)行功能分類，并發(fā)現(xiàn)顯著性富集的功能條目。

       

高級分析：
（1）DNA甲基化位點motif分析
通過序列分析結(jié)合生物信息學(xué)手段就可確定DNA甲基化修飾偏好序列，找到DNA甲基化特征Motif。

（2）DNA甲基化位點共有和特異性分析
根據(jù)注釋信息，繪制組間共有和特異性的甲基化修飾位點或基因。

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