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2018國自然研究熱點一：環(huán)狀RNA研究深度剖析

瀏覽次數(shù)：5573　發(fā)布日期：2018-3-1　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

1.環(huán)狀RNA為什么火？它到底是何方神圣？
2013年兩篇Nature[1][2]文章的出世，徹底顛覆了我們對RNA的傳統(tǒng)認知，同時也迅速引爆了整個生物醫(yī)學界！經過嚴格統(tǒng)計匯總后，2017年國家自然科學金獲批的項目中環(huán)狀RNA研究相關的項目總數(shù)高達176項，其中有兩項杰出青年基金，一項優(yōu)秀青年基金，兩項重點項目，94項面上項目，62項青年基金項目，15項地區(qū)科學基金項目。

從獲批學科方向角度分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤學方向是環(huán)狀RNA研究獲批項目中最多的學科方向，而消化系統(tǒng)相關腫瘤是其中獲批最多的學科單項，除此之外，循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)狀RNA研究也是異軍突起，一躍成為第二大環(huán)狀RNA研究領域。其實醫(yī)學方向除了腫瘤學和循環(huán)系統(tǒng)以外，其他方向也都獲得資助，比如中醫(yī)學和藥理學方向，相信未來其他類型的腫瘤和學科方向必定會爭取更多的環(huán)狀RNA課題資助。與此同時，生命科學方向環(huán)狀RNA研究顯得略微低調些，從獲批的16個項目來看，基礎的遺傳學和生物信息學(C06)和畜牧業(yè)(C1701)相對受到更多的重視，相信如果突破相關研究領域的技術瓶頸，在生命科學方向會出現(xiàn)更多的環(huán)狀RNA研究項目。

從獲批研究內容分析，發(fā)現(xiàn)與2016年相比，2017年獲批的項目中，只進行環(huán)狀RNA表達譜分析的課題非常少，絕大部分是針對環(huán)狀RNA的功能機制展開，這表明環(huán)狀RNA研究已經實現(xiàn)從基礎篩選到特定功能機制研究的過度。值得一提的是，其中環(huán)狀RNA與microRNA相互作用是目前最常見的，也是項目數(shù)占比最多的研究思路，另外外泌體來源的環(huán)狀RNA項目也比較多，也是目前環(huán)狀RNA的重要方向。

那么接下來，小編將從以下幾個角度講解環(huán)狀RNA目前的研究思路。

環(huán)狀RNA是什么？

環(huán)狀RNA（circRNAs）是一類不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環(huán)形結構的非編碼RNA分子。目前發(fā)現(xiàn)的circRNAs主要來源于基因外顯子exon，但還有其他類型，比如來源于內含子intron，基因間intergenic，反義鏈antisense，重疊區(qū)sense overlapping。

circRNA的主要特征有哪些呢？

(1)circRNA由于反式剪切，大量存在于真核細胞的細胞質中（定位于細胞質是miRNA海綿機制研究的充分必要條件），少部分內含子來源的circRNA存在于核酸內，具有一定的組織特異性、時序和疾病特異性（灰常適合做分子標志物哦）。circRNA廣泛存在于人體細胞中，有時超過其線性異構體10倍之多。

(2)與傳統(tǒng)線性RNA相比，circRNA分子沒有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，呈封閉環(huán)狀結構，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩(wěn)定。（RNaseR耐受實驗，驗證circRNA的環(huán)形結構）

(3)部分circRNA含有miRNA應答元件，可充當競爭性內源RNA（ceRNA），與miRNA結合，在細胞中起到miRNA海綿作用，進而解除miRNA對靶基因的抑制作用，上調靶基因的表達水平。（具體研究見下）

(4)可以翻譯成蛋白質，但大部分是非編碼RNA。（與表觀結合：可通過m6A甲基化翻譯蛋白質[3]）

2.環(huán)狀RNA的研究思路是怎樣的呢？

所謂兵馬未動，糧草先行！環(huán)狀RNA的研究也是一場沒有硝煙的戰(zhàn)爭，須得搶占先機，方能知己知彼，百戰(zhàn)不殆。為了各位在這場“戰(zhàn)爭”中取得勝利，云序生物為大家準備了環(huán)狀RNA研究的思路寶典，如下。

從文章的工作量、難易程度及雜志發(fā)表角度看，小編把環(huán)狀RNA研究思路分為表達譜分析，生物標志物，功能機制研究三大類。那么接下來小編將從這三個角度給大家詳述。

不論從哪一個角度，首先需要確定好研究物種，疾病模型，樣品類型等基本信息。接下來，通過高通量手段即RNA-seq（云序提供全轉錄組-seq或circRNA-seq）或文獻報道，篩選差異表達的circRNA。如果想短平快的發(fā)表3-5分的文章，那么表達譜分析顯得再合適不過了。如果有大量的臨床樣本，那么做分子標志物也是很easy的，思路和表達譜分析相似如下圖展示，不過多了臨床樣本的統(tǒng)計和驗證。（比如KM曲線，ROC曲線，PAM分析等等）

接下來，便是重頭戲，circRNA功能機制研究如何進行呢？

這要看各位想從哪個角度入手了。目前circRNA研究的功能機制大致分為：miRNA海綿，與功能蛋白結合，順勢調控來源基因表達，還有就是circRNA上發(fā)生RNA甲基化可翻譯蛋白質等。其中miRNA海綿是目前做的最普遍，也是目前申請的國自然里占比最多的。接下來小編會好好介紹一下這一方面的研究思路及研究方法。

miRNA海綿機制：

通過高通量測序手段得到一批數(shù)據(jù)后，很多人會犯愁到底怎么運用數(shù)據(jù)呢？想必下面這篇文章[4]大家都爛熟于心了吧？那么小編再次帶大家領略一下高分環(huán)狀RNA的風采。

高通量測序產生的數(shù)據(jù)，需要進一步實驗手段進行驗證。而在諸如Nature communication這類高分雜志中，驗證工作可謂是面面俱到。不僅包括表達量驗證，還包括結構驗證，細胞定位及功能驗證等。有的甚至還包括環(huán)狀RNA形成機制的研究，在這兒不贅述。

體外差異環(huán)狀RNA的驗證

a表達量驗證：qPCR

b結構驗證：由于circRNA不易被核酸外切酶RNaseR降解，比線性RNA更穩(wěn)定�？赏ㄟ^RNase R耐受性實驗驗證其環(huán)形結構。

c細胞定位：由于circRNA是在細胞質中發(fā)揮miRNA海綿機制，因此需要通過核質分離實驗或FISH驗證其在細胞中的定位。

d功能驗證：對上述步驟篩選出的1-2條circRNA設計siRNA或者過表達質粒，通過一系列細胞表型實驗，驗證circRNA所發(fā)揮的細胞功能。最終挑選表型最為顯著的circRNA做后續(xù)機制研究。

圖示：差異circRNA驗證左：RNaseR耐受實驗右：FISH定位

圖示：差異環(huán)circRNA左：敲除實驗中：細胞侵襲右：細胞遷移實驗

目標circRNA的機制研究

a RIP-qPCR：挑選功能最為明顯的1個circRNA做RIP-qPCR實驗，檢測circRNA是否與AGO2蛋白結合。（AGO2是circRNA發(fā)揮海綿作用的指示蛋白）

b RNA pull down：對上述circRNA進行RNA pull down實驗，拉下來的RNA進行定量PCR檢測，檢測生信預測中與該circRNA結合的10-20疾病miRNA。

c luciferase assay：根據(jù)上步結果為circRNA挑選3個左右的miRNA做后續(xù)熒光素酶實驗(miRNA與circRNA表達趨勢一致)，分別構建circRNA的熒光素酶載體，miRNA結合位點突變的熒光素酶載體。

將circRNA熒光素酶載體與3個miRNA mimics共轉染至細胞，檢測熒光活性，證明環(huán)狀RNA和miRNA mimics的結合。

d miRNA功能實驗：選定1個miRNA研究其對某一確定細胞表型和靶基因表達水平的影響（如：遷移）；

e 恢復性實驗：分別研究：單獨轉染nc mimics或單獨轉染miRNA mimics或單獨轉染環(huán)狀RNA過表達質粒，及共轉染環(huán)狀RNA+miRNA mimics對某一確定細胞表型和環(huán)狀RNA表達水平的影響。

f 回補性實驗：敲除circRNA后，過表達靶基因，檢測靶基因是否能逆轉circRNA敲除導致的表型變化。

圖示：差異環(huán)狀RNA左：Ago2 RIP 中：熒光素酶篩選系統(tǒng) 右：miRNA pull down

既然是真情回饋，那么小編在這兒就給大家透露一個更容易get的研究海綿機制的思路如下圖�？梢�同時做一下circRNA-seq和AGO2 RIP-seq，這樣重疊部分的結果便是可能發(fā)揮海綿作用的circRNA。進而通過RNA pull down-WB反向驗證circRNA與AGO2的相互作用，其他功能實驗與上述一致。

可如果我的circRNA不是海綿機制，咋辦？別怕，小編給你出大招！

circRNA結合功能蛋白：

當你發(fā)現(xiàn)自己的circRNA不是發(fā)揮海綿作用的時候，是不是有種淚奔的感覺？

別怕，小編這就給你吃一顆定心丸。原來circRNA不僅可以與miRNA結合發(fā)揮海綿作用，還可以結合功能蛋白發(fā)揮作用呢！下面這篇就是很好的例子！和大家一樣，這篇文章的作者也是先通過AGO2 RIP實驗驗證了他的circANRIL是否結合AGO2，但不幸的是，結果證實他徹底的和miRNA海綿say goodbye了，頓時小編也是捏了一把冷汗。可作者竟然奇跡般地扭轉了局勢，通過RNA pull down探索了circANRIL上結合的蛋白，并通過RIP反向證實了circRNA是通過與PES1蛋白結合參與了rRNA的成熟過程。想來功夫不負有心人，這篇文章也是成功地發(fā)表在Nature communication上[5]。

circRNA順勢調控來源基因表達：

這里小編給大家準備了一個被掩藏許久了的環(huán)狀機制：circRNA順勢調控來源基因表達的研究思路，即通過特異的RNA-RNA互作來調控轉錄。

這篇文獻，作者首先通過CLIP-seq（檢測RNA結合蛋白下游的RNA）發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶II上結合了一些circRNA。并且通過鑒定，發(fā)現(xiàn)是外顯子與保留在外顯子之間的內含子形成的環(huán)狀RNA，命名為外顯子-內含子circRNAs（EIciRNAs），其中顯著富集的circEIF3J和circPAIP作為后續(xù)研究對象。研究這通過FISH定位發(fā)現(xiàn)其定位于細胞核，這提示作者可能不能走miRNA海綿的路子了。So what？

作者通過反義核苷酸技術沉默circEIF3J和circPAIP后檢測來源基因表達，證實了其可調控來源基因表達。RNA-DNA共定位FISH也證實EIciRNAs與其來源基因共定位于細胞核中。此外這兩個EIciRNAs與Pol II互作關系也都使作者提出一個大膽的猜想：EIciRNAs可能對其來源基因有調控作用。

帶著這樣的猜想，接下來作者先后通過RNA pull down（檢測RNA與RNA/蛋白作用）和CHIRP（是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。）實驗分析了與兩個EIciRNAs相互作用的蛋白及RNA。結果發(fā)現(xiàn)EIciRNAs不僅可以與Pol II結合，還與U1A和U1C snRNP結合（它參與真核生物細胞核中RNA的加工。snRNA和許多蛋白質結合在一起成為小核核糖核蛋白(snRNP即small nuclear ribonucleoproteins)，參與信使RNApre-mRN的剪接，使后者成為成熟mRNA。），且在細胞核內互作（FISH）。CHIRP實驗證實EIciRNAs同Pol II、U1 snRNP共同結合于其來源基因轉錄起始位點上游300bp處，并且U1 snRNP的結合是必需的[8]。

circRNA翻譯蛋白質：

假如這一切都不足以吸引你的眼球，那么接下來的這個案例可能會讓你“跌破眼鏡”。最初我們認為circRNA屬于非編碼RNA，不能發(fā)揮編碼蛋白質的功能，那么事實真的如此么？Cell Research[3]這篇文章便告訴你：大錯特錯！環(huán)狀RNA沒有游離的5’和3’端，因此如果可以翻譯的話一定是通過不依賴于5’帽子結構的方式。根據(jù)目前報道的環(huán)狀RNA翻譯蛋白的調控元件包括IRES和m6A修飾兩種途徑。

已知一些mRNA可以不依賴于帽子結構而靠一個叫內部核糖體進入位點(IRSE)的順式調控元件來從mRNA的中間啟動翻譯，作者基于這種思想，檢測發(fā)現(xiàn)自己的環(huán)狀RNA上并沒有IRES，卻同樣可以翻譯蛋白。然而一直有報道稱m6A可調控翻譯，但并沒有系統(tǒng)的研究，作者大膽猜想是否環(huán)狀RNA上也發(fā)生了m6A修飾，并調控蛋白翻譯呢？

結果不出所料，環(huán)狀RNA的翻譯可被RNA甲基化酶調控。作者通過一系列實驗證實YTHDF3可識別circRNA上發(fā)生的m6A修飾，并招募翻譯起始因子eIF3A和eIF4G2等，起始蛋白翻譯。

不僅如此，環(huán)狀RNA編碼的蛋白質還是有功能的呢，如下面兩篇文章[6][7]。

說道翻譯蛋白質的研究思路，稍微復雜一些，那么小編給大家總結一下。

1. 翻譯啟動元件預測分析：

IRES是internal ribosome entry site的簡寫，是一種具備募集核糖體并實現(xiàn)核糖體組裝和后續(xù)閱讀框翻譯蛋白的RNA調控元件。

2. 閱讀框預測：

閱讀框是Open Reading Frame的簡寫，指在核酸序列中從ATG開始（RNA中是AUG），三個堿基一組，直至出現(xiàn)TAA，TAG或TGA（RNA中A變成U）終止密碼子的序列。

3. 載體表達驗證實驗：

通過構建正常元件和元件突變載體，即把預測到的IRES或m6A修飾位點突變掉，看后續(xù)的翻譯是否正常進行。

4. 閱讀框表達驗證實驗：

通過在原有的閱讀框前端增加標簽序列，包括3×Flag等標簽，驗證閱讀框產物在生理條件下是否可以實現(xiàn)。

5. 內源性翻譯產物鑒定：

通過制備特異性抗體進行Western等檢測實驗。這部分需要進行抗體特異性證明實驗，包括模擬翻譯產物的過表達和敲除實驗等，特異性可以通過WB和IP下來質譜鑒定。

6. 核糖體結合分析：

基于蔗糖密度梯度離心的核糖體分離技術，鑒定環(huán)狀RNA上是否結合核糖體，以及結合的多少。

7. 翻譯產物過表達和敲低（除）實驗：

通過構建過表達或敲低/敲除體系，看不同含量的翻譯產物對細胞生理指標的影響情況。

3.環(huán)狀RNA項目國自然申請建議

(1)避免單純設計表達譜的研究內容。盡早進行表達譜分析，找到有研究價值的目標環(huán)狀RNA，并開展一些簡單的驗證實驗，最好能形成大致的功能機制研究的輪廓。

(2)開展新穎的環(huán)狀RNA研究方向。包括對尚未報道或極少報道的病理或生理模型相關的環(huán)狀RNA篩選鑒定，或者機制研究方向上，比如miRNA海綿，與功能蛋白相互作用，與表觀水平結合，翻譯蛋白質方向等。

(3)利用多種有效地分析環(huán)狀RNA與其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down，CLIP等實驗技術，如果能得到有效數(shù)據(jù)，會在國自然科學基金申請中增色不少。

參考文獻

1.Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.[J]. Nature, 2013, 495(7441):333.

2.Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441):384-388.

3.Yun Y, Fan X, Mao M, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J]. Cell Research, 2017, 27(5):626.

4.Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature Communications, 2016, 7(11215):11215.

5.Holdt L M, Anika S, Kristina S, et al. Circular non-coding RNAANRILmodulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans:[J]. Nature Communications, 2016, 7:12429.

6.Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22.

7.Yang Y, Gao X, Zhang M, et al. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2018, 110(3).

8.Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2015, 22(3):256.

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