定義

中空纖維測試法（HFA）是一種快速的體內(nèi)分析技術(shù)，可用于評估藥物的細胞毒性效應(yīng)，而通過將人體腫瘤細胞封裝培養(yǎng)于中空纖維內(nèi)并植入裸鼠皮下或腹腔，即可以用于評估待測化合物的藥效。

特性

評估潛在抗腫瘤藥物的活性可通過多種體內(nèi)模型，包括異種移植、原位模型和HFA。HFA方法經(jīng)美國國家癌癥研究所（NCI）改良，已成為一種獨特的藥物研發(fā)體內(nèi)模型。HFA可在同一實驗動物的2個不同部位評估抗腫瘤藥物對多個不同細胞系的效力。HFA使用具有良好生物相容性的半滲纖維膜，纖維內(nèi)腔可封裝腫瘤細胞，適用于不同組織源性和細胞特性的腫瘤細胞。纖維采用聚偏氟乙烯（PVDF）材質(zhì)，內(nèi)徑0.5-1mm，長2cm，截留分子量500,000Da。因此，可溶性生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)，包括腫瘤細胞或宿主所產(chǎn)生的生長因子）可透過纖維膜壁，而腫瘤細胞和宿主細胞不會直接相互接觸。纖維通常植入裸鼠，也可以植入大鼠或其它實驗動物，以用于抗腫瘤藥物的臨床前研究。一只小鼠最多可接受6種腫瘤細胞系植入，因而，可在同一實驗動物上同時進行多種細胞系的檢測。因為宿主的免疫細胞不會滲入中空纖維內(nèi)腔引起免疫反應(yīng)而妨礙腫瘤細胞生長，所以纖維可用于植入到免疫功能不全或免疫功能完全的小鼠品系。纖維可植入腹腔（i.p.）或皮下（s.c.），所以經(jīng)靜脈（i.v.）、口腔、i.p.及s.c.給藥有助于評估肝通過效果，為進一步的細胞毒性和抗血管形成化學(xué)治療體內(nèi)測試提供給藥劑量、給藥周期的評估信息。給藥處理完成后，可研究分析活細胞增殖和細胞特性，包括細胞周期分布、DNA損壞誘導(dǎo)、細胞死亡誘導(dǎo)（凋亡）、蛋白質(zhì)表達水平以及細胞形態(tài)等。此外，也可以分析體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)，包括藥物運輸、pH、pO2。

NCI推薦12個腫瘤細胞系用于常規(guī)抗腫瘤藥物活性中空纖維篩選檢測。對于在體外抗腫瘤藥物篩選中已確認有可重復(fù)活性的藥物，這可作為確定藥物潛在活性的初步體內(nèi)評估。HFA有助于選擇可優(yōu)先用于進一步移植瘤模型篩選的化合物，大大減少直接進行移植瘤檢測所需活性化合物的用量。NCI HFA檢測一種化合物對12個腫瘤細胞系的作用只需要24只小鼠，而在NCI移植瘤模型中，一種化合物對應(yīng)一種移植瘤模型，整個實驗約需要50只小鼠。使用HFA進行早期臨床前藥物篩選，符合實驗動物替換、改善、優(yōu)化（3R）的原則，有助于控制實驗動物的使用。

自其成功開發(fā)以來，已有多個科研小組通過HFA進行藥物活性篩選。HFA已成功用于化合物對原始人體腫瘤細胞以及定性腫瘤細胞系效力的研究。HFA體內(nèi)分析不僅可成功用于抗腫瘤活性的定量研究，其應(yīng)用也在不斷得到擴展。HFA已經(jīng)用于抗病毒藥物的評估，也適用于其它醫(yī)療領(lǐng)域。

體內(nèi)HFA可用于預(yù)測藥物對移植瘤的活性。在移植瘤模型中，抗腫瘤活性通常通過腫瘤體積的相對降低來確認。而在HFA中，活性可通過活細胞數(shù)量的降低來確認，后者可通過MTT分析來檢測。在移植瘤模型中具有活性的化合物通常在HFA中也具有活性。

移植瘤模型一般不能簡單地闡釋化合物在腫瘤中作用機制。從移植瘤模型中收獲腫瘤細胞進行藥效學(xué)研究通常由于宿主細胞的干擾而非常困難。生長于中空纖維內(nèi)的細胞是獨立的細胞懸液，而無宿主細胞污染，可輕松地回收，用于機制研究。使用HFA進行臨床前研究，可縮短將藥用化合物用于臨床研究的時間。但在某些情況下可能需要獲得更多關(guān)于腫瘤細胞-基質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，這將是對HFA模型進行優(yōu)化的新要求。

相比傳統(tǒng)動物模型，HFA具有諸多優(yōu)勢。首先，HFA可以最短的時間（低于2周）和最少的材料（如待測化合物）得出藥效的定量指標，而不會受到移植瘤模型大規(guī)模動物實驗的成本限制。其次，在動物模型中進行研究需要大量的時間和精力進行檢測操作，特別是當待測化合物只具有極弱的抗腫瘤活性時。采用HFA，可免去在移植瘤模型中檢測無活性化合物的過程。第三，在組織培養(yǎng)研究中具有良好效果的腫瘤治療方式，在實體瘤中往往效果欠佳，原因可能是腫瘤在三維結(jié)構(gòu)的生長過程中，其增殖性能和微環(huán)境異質(zhì)性會有差異，而細胞在中空纖維中可以三維結(jié)構(gòu)方式生長。第四，這種檢測方法可將藥物的藥效動力學(xué)以及潛在的生物轉(zhuǎn)化納入考量范圍。第五，HFA是進行聯(lián)合用藥初步體內(nèi)實驗的絕佳方法，因為化合物會有一個動態(tài)的體內(nèi)相互作用過程。第六，HFA可以使實驗小鼠免受移植瘤誘導(dǎo)的惡病質(zhì)影響。

HFA尚不能完全替代傳統(tǒng)的移植瘤模型。移植瘤細胞在生長以及與宿主組織的相互作用時復(fù)雜的反應(yīng)不能分析。細胞不能轉(zhuǎn)移到動物的其它器官，因為纖維防止了細胞的遷移。盡管使用纖維時不會誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，新血管的形成仍可供給纖維營養(yǎng)物質(zhì)，這可能由纖維內(nèi)腫瘤細胞釋放的生長因子所誘導(dǎo)。中空纖維可用于評估化合物到達不同生理部位（s.c.和i.p.）腫瘤細胞的能力，并評估藥物在腫瘤細胞內(nèi)是否可以達到藥物活性濃度。使用現(xiàn)代生物發(fā)光技術(shù)，可觀察細胞在纖維內(nèi)的動態(tài)生長過程。

方法

HFA可按以下步驟操作：從處于對數(shù)期的體外培養(yǎng)中按所需細胞密度收獲腫瘤細胞。將細胞懸液注入中空纖維，兩端熱密封，防止細胞流出。密度取決于待測細胞系，從1-100 X 10⁵ cells/fiber不等。植入宿主前，將纖維置于組織培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下孵育24-48hr。植入當天，可使用MTT法對每個腫瘤細胞系樣品進行活細胞計數(shù)。纖維植入后數(shù)日，按所需劑量和周期給予實驗小鼠抗腫瘤藥物處理，最長可持續(xù)2周。給藥結(jié)束后，從宿主回收纖維，進行MTT分析。計算每個細胞系的凈生長百分比，與對照組凈生長百分比比較。此外，也可以進行其它細胞學(xué)分析。

參考文獻

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