2. 1μ阿片受體

μ受體基因敲除小鼠, 其后代符合孟德爾遺傳規(guī)律, 28. 6 %野生型, 46. 6 %雜合子, 24. 8 %的純合子 , 說明突變的μ受體基因缺陷小鼠沒有發(fā)生宮內(nèi)和出生后死亡。這種小鼠的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖和活動(dòng)周期等與正常小鼠無(wú)明顯差異。放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示 ,μ受體 KO 小鼠沒有任何μ受體存在,但δ和κ受體的數(shù)量和分布未受影響[2 ]。

藥物是選擇性較高的μ阿片受體激動(dòng)劑, 其對(duì)WT小鼠有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用, 但在μ受體 KO小鼠不出現(xiàn)鎮(zhèn)痛。在浸尾、甩尾和熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中,對(duì)μ受體KO小鼠皮下注射藥物達(dá)到 50 mg·kg- 1,鞘內(nèi)或腦室內(nèi)注射藥物劑量達(dá)到WT小鼠鎮(zhèn)痛ED50的15倍都不產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。表明μ阿片受體基因編碼的受體對(duì)介導(dǎo)藥物在痛通路中的作用是必須的。在同樣實(shí)驗(yàn)條件下,藥物在κ、δ受體KO小鼠仍有鎮(zhèn)痛作用, 證明了κ和δ受體不參與介導(dǎo)藥物鎮(zhèn)痛。用條件性位置偏愛方法評(píng)價(jià)藥物的欣快效應(yīng)證明藥物(3 mg·kg- 1sc)在 WT 小鼠產(chǎn)生 CPP 效應(yīng) ,而在μ受體 KO 小鼠不能引起 CPP 效應(yīng)。慢藥物物給藥使 WT 小鼠形成身體依賴性, 納洛酮誘發(fā)其出現(xiàn)戒斷癥狀, 同樣處理μ受體 KO 小鼠不出現(xiàn)戒斷癥狀。重復(fù)藥物給藥使 WT 小鼠腦內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的活性上調(diào), 而在μ受體 KO 小鼠腦不產(chǎn)生腺苷環(huán)化酶活性上調(diào) [3 ], 說明藥物產(chǎn)生的精神依賴性和身體依賴性是μ阿片受體介導(dǎo)的, μ阿片受體基因編碼的產(chǎn)物是藥物藥理效應(yīng)的既定的分子靶位。

2. 2κ阿片受體

κ受體 KO 小鼠的自發(fā)活動(dòng)與 WT 小鼠無(wú)差別。κ受體激動(dòng)劑 U50488H 在κ受體 KO 小鼠不引起鎮(zhèn)痛作用 , 也不形成條件性位置厭惡效應(yīng), 而在WT 小鼠出現(xiàn),表明κ受體在κ激動(dòng)劑作用中的重要性。藥物在κ受體 KO 小鼠的鎮(zhèn)痛作用和條件性位置偏愛效應(yīng)與 WT 小鼠無(wú)差別, 但藥物的戒斷癥狀則明顯弱于 WT 小鼠, 說明κ受體不參與藥物的鎮(zhèn)痛和獎(jiǎng)賞效應(yīng), 但參與調(diào)節(jié)藥物的身體依賴性[4 ]。

2. 3δ阿片受體

在δ阿片受體基因敲除小鼠,δ受體激動(dòng)劑DPDPE 的鎮(zhèn)痛作用在脊髓水平明顯減弱, 但在脊髓上水平的鎮(zhèn)痛作用與野生型無(wú)差異, 說明δ受體在不同部位的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中所起的作用不一樣。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)δ受體敲除小鼠不對(duì)藥物的鎮(zhèn)痛作用產(chǎn)生耐受性 [5 ], 但δ受體敲除小鼠在依賴性中的作用還有待于進(jìn)一步研究。

3 敲除多巴胺受體或多巴胺遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因

多巴胺 (DA) 系統(tǒng)是藥物精神依賴性的神經(jīng)基礎(chǔ), 中腦邊緣DA 系統(tǒng)是“獎(jiǎng)賞系統(tǒng)”中最重要的一環(huán)。DA 受體亞型有兩類: D1 樣 (D1 和D5 受體) 和D2樣(D2、 D3 和D4 受體) ,不同的DA 受體亞型在藥物獎(jiǎng)賞中發(fā)揮的作用也不相同。利用基因敲除技術(shù)已經(jīng)培育出了D1、 D2、 D3、 D4 受體缺陷的實(shí)驗(yàn)小鼠,為探討DA 受體在藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)中的作用提供了依據(jù)。

3. 1 D1 受體

D1 受體 KO 小鼠基礎(chǔ)性活動(dòng)多于 WT 小鼠�？煽ㄒ蚰苁� WT 小鼠活動(dòng)增加,而不能使D1 受體 KO小鼠活動(dòng)增加, 但可卡因的位置偏愛效應(yīng)在兩種小鼠都出現(xiàn)[6 ]。苯丙胺反復(fù)給藥的行為敏化現(xiàn)象在D1 受體 KO 小鼠低于 WT 小鼠; 苯丙胺在D1受體KO小鼠和WT小鼠都形成自身給藥, 但 KO 小鼠的陽(yáng)性反應(yīng)率低于 WT 小鼠[7 ]。這些實(shí)驗(yàn)說明D1 受體激活可能是可卡因、苯丙胺運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)所必需的,而不是獎(jiǎng)賞效應(yīng)所必需的。但這與正常 WT 型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致, 因?yàn)樵谡�常�? D1 受體拮抗劑可抑制藥物的自身給藥和偏愛效應(yīng)。造成這種不一致的原因可能與受體拮抗劑的特異性有關(guān), 也可能與基因敲除小鼠的遺傳異常有關(guān)。

3. 2 D2 受體

在阿片類誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中, D2 受體KO 小鼠對(duì)內(nèi)源性和外源性阿片類物質(zhì)誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)與 WT 小鼠無(wú)顯著性差異, 表明 D2 受體缺失未影響阿片誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)。在藥物身體依賴性實(shí)驗(yàn)中,D2 受體 KO 小鼠和 WT 小鼠的戒斷癥狀沒有明顯差別,說明 D2 受體在阿片身體依賴性中不起重要作用。在位置偏愛實(shí)驗(yàn)中, D2 受體 KO小鼠不對(duì)藥物形成偏愛效應(yīng), 但對(duì)食物形成偏愛效應(yīng) ,說明 D2 受體在精神依賴性中起重要作用; 并且藥物獎(jiǎng)賞和自然獎(jiǎng)賞效應(yīng)的機(jī)制可能不同[8 ]。

3. 3 D3 受體

與WT小鼠相比,D3受體KO小鼠的基礎(chǔ)活動(dòng)增加 ,低劑量的可卡因可D3受體KO小鼠活動(dòng)增加 ,但在高劑量下與 WT 型無(wú)差別。D3受體KO小鼠對(duì)苯丙胺的偏愛效應(yīng)更敏感, 因?yàn)楹苄�劑量的苯丙胺就能使其形成位置偏愛。Xu[9 ]認(rèn)為正常情況下D3受體可能起著對(duì)抗D1和D2受體的作用,在D3受體KO小鼠 ,這種 D3 受體的對(duì)抗作用沒有了,使苯丙胺的作用更加明顯,較小劑量就能發(fā)揮效應(yīng)。

3. 4 D4 受體

D4 受體 KO小鼠基礎(chǔ)活動(dòng)降低, 對(duì)D4受體激動(dòng)劑氯氮平的敏感性也降低,但乙醇、可卡因、藥物基苯丙胺使D4受體KO小鼠活動(dòng)增多[10 ],其機(jī)制還不清楚。關(guān)于D4受體KO小鼠的依賴性特性還缺乏研究資料。

3. 5 DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體

DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine t ransporter , DAT)位于突觸前膜,重?cái)z取突觸間隙中的DA進(jìn)入神經(jīng)末梢,是終止DA生理效應(yīng)的主要方式。DAT KO小鼠體重增長(zhǎng)緩慢,成熟之前易死亡,但生殖能力旺盛,母鼠分娩后缺乏哺乳行為。該自發(fā)活動(dòng)明顯增加, 但對(duì)可卡因和苯丙胺的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)或刻板活動(dòng)特性反應(yīng)減弱 , 說明 DAT 是可卡因和苯丙胺的作用靶位點(diǎn)。在依賴性實(shí)驗(yàn)中,可卡因使 WT 型和 DAT KO小鼠都形成靜脈自身給藥和偏愛效應(yīng)[11 ],藥物同樣可使 KO 型形成偏愛效應(yīng)[12 ]。與之相矛盾的是,在正常鼠 ,DAT 阻滯劑可以抑制可卡因的自身給藥。

3. 6 囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體

囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體 (vesicular monoamine t rans2porter , VMAT) 的作用是將單胺類從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡儲(chǔ)存,分為1型和2型, VMAT2 主要分布于神經(jīng)末梢,對(duì)DA、組胺、5 - HT 等單胺類特異性較高。Wang 等[13 ]培育了VMAT2基因缺陷小鼠, 發(fā)現(xiàn)該小鼠成活率低, 出生后幾天內(nèi)即死亡, 以后的實(shí)驗(yàn)只能用雜合子和 WT 型進(jìn)行。在雜合子小鼠,紋狀體 DA 濃度很低, K+和苯丙胺誘發(fā)的DA 釋放作用也降低, 說明在雜合子 VMAT2 的功能也受到影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雜合子小鼠對(duì)可卡因、苯丙胺和乙醇的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)效應(yīng)比 WT 型更敏感; 苯丙胺誘發(fā)WT 型產(chǎn)生偏愛效應(yīng), 而不誘發(fā)雜合子產(chǎn)生偏愛效應(yīng)[14 ]。這些結(jié)果反映 VMAT2 參與維持藥物的獎(jiǎng)賞效應(yīng)。4 敲除 5 - HT受體和 5 - HT轉(zhuǎn)運(yùn)體基因研究表明 5 - 羥色胺(5 - HT) 系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)藥物的獎(jiǎng)賞效應(yīng), 但目前只培育了 5 - HT1B 受體 KO小鼠和 5 - HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體 KO 小鼠。

4. 1 5 - HT1B 受體

在 5 - HT1B受體KO小鼠,可卡因累進(jìn)比率自身給藥實(shí)驗(yàn)中的“終點(diǎn)”(break point )明顯高于WT小鼠,對(duì)食物形成的強(qiáng)化效應(yīng)在兩種小鼠相同,表明5 - HT1B 受體KO小鼠對(duì)可卡因更易形成自身給藥。

在 5 - HT1B 受體KO小鼠,可卡因誘發(fā)的自發(fā)活動(dòng)和刻板運(yùn)動(dòng)強(qiáng)于WT型; 慢性給可卡因, WT的刻板運(yùn)動(dòng)逐日增加, 而5- HT1B受體KO小鼠從d2起不再增加; 由此可見, 5 - HT1B 受體KO小鼠對(duì)可卡因引發(fā)的自發(fā)活動(dòng)增強(qiáng)更敏感, 而WT小鼠對(duì)可卡因的刻板運(yùn)動(dòng)更敏感。一般認(rèn)為, 黑質(zhì)紋狀體DA 系統(tǒng)與刻板運(yùn)動(dòng)有關(guān), 中腦邊緣DA系統(tǒng)與自發(fā)活動(dòng)和獎(jiǎng)賞效應(yīng)有關(guān)。因此, 以上實(shí)驗(yàn)說明在5 - HT1B 受體 KO 小鼠 , 中腦邊緣 DA 系統(tǒng)的活動(dòng)更為突出。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,KO 型小鼠伏隔核的△FosB 等 Fos 相關(guān)抗原表達(dá)增強(qiáng),這種增強(qiáng)在 WT小鼠慢性給可卡因時(shí)出現(xiàn), 說明5 - HT1B受體 KO小鼠遺傳上的特點(diǎn)與 WT 小鼠慢性給可卡因出現(xiàn)的變化相似。因此, 興奮劑對(duì)5 - HT1B 受體KO小鼠更易產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)[15 ]。但最近卻發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)果,可卡因不能使 5 - HT1B 受體 KO 小鼠形成位置偏愛效應(yīng)[16 ]。結(jié)果不一致的原因有待于進(jìn)一步研究。4. 2 5 - HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體5 - HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin t ransporter ,5 - HTT)位于 5 - HT 神經(jīng)元的突觸前膜,重?cái)z取突觸間隙中的 5 - HT 進(jìn)入神經(jīng)末梢。在5 - HTT KO 小鼠模型上 , 可卡因仍能形成偏愛效應(yīng), 說明 5 - HTT 的缺失不影響可卡因的獎(jiǎng)賞效應(yīng)[11 ]。

5 敲除 CB1 受體基因

大麻受體分為CB1和CB2型受體 , CB1型受體主要分布于神經(jīng)系統(tǒng) ,與大麻的精神作用有關(guān)。Ledent等[17 ]培育了CB1受體KO小鼠。對(duì)WT型及CB1受體KO小鼠都給予△9- THC , 發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)痛、活動(dòng)減少、體溫降低、血壓下降、戒斷反應(yīng)及自身給藥等作用在 WT 小鼠出現(xiàn),而在 CB1 受體 KO 小鼠不出現(xiàn) , 說明大麻類的主要藥理學(xué)特性是由CB1受體介導(dǎo)的。

若將兩種鼠都用阿片類處理, 發(fā)現(xiàn)藥物急性給藥的鎮(zhèn)痛、降溫作用和多次給藥的鎮(zhèn)痛耐受現(xiàn)象,以及 U50488H 的鎮(zhèn)痛和活動(dòng)減少效應(yīng)在兩種鼠沒有差別。但與 WT 型相比 ,CB1 受體 KO 小鼠的藥物戒斷癥狀明顯減輕,藥物自身給藥現(xiàn)象明顯減弱,也不對(duì) U50488H 形成條件性位置厭惡效應(yīng), 說明阿片類的身體依賴性和精神依賴性都與CB1 受體有關(guān)。另有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在 CB1 受體 KO 小鼠 , 藥物不能引起伏隔核DA 釋放[18 ],說明 CB1 在藥物促伏隔核DA釋放中發(fā)揮一定作用。

6 敲除一氧化氮合酶基因

在神經(jīng)系統(tǒng),一氧化氮(NO)可作為一種信息傳遞物質(zhì)參與腦內(nèi)多種生理功能。近年來(lái)證明,NO 參與藥物耐受和依賴, NO合酶(NOS)抑制劑可減輕阿片的戒斷癥狀。而敲除 NOS 基因的小鼠對(duì)可卡因的運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)和行為敏化反應(yīng)減弱, 對(duì)可卡因也不形成位置偏愛[19],進(jìn)一步驗(yàn)證了NO在藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)中的作用。

7 其它

不同實(shí)驗(yàn)室還培育了許多敲除其它基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 , 其中有些做過與藥物依賴性有關(guān)的實(shí)驗(yàn)。如: 可卡因急性給藥可誘導(dǎo)正常鼠前皮質(zhì)組織纖溶酶原激活因子 (t issue plasminogen act ivator, t PA)表達(dá), 在KO小鼠 ,可卡因的活動(dòng)增強(qiáng)和行為敏化效應(yīng)比WT型強(qiáng); KO和WT 型都能形成可卡因的自身給藥, 但形成自身給藥后如果只給信號(hào)刺激不給可卡因, WT型壓桿率降低 , 而KO型壓桿率不降低,說明tPA在依賴性中可能發(fā)揮比較特殊的作用[20 ]。再如:尼古丁可刺激WT小鼠紋狀體釋放DA ,而在敲除N型膽堿受體β2亞單位的小鼠,尼古丁就沒有這種作用。說明N受體參與尼古丁的精神依賴性[21]。最近發(fā)現(xiàn)敲除P物質(zhì)受體,藥物的戒斷癥狀和獎(jiǎng)賞效應(yīng)都減弱[22 ]。

8 結(jié)語(yǔ)

利用基因敲除技術(shù)選擇性敲除某特定基因, 為研究該特定基因在依賴性中作用提供了直接依據(jù)。利用該模型研究各種遞質(zhì)受體、轉(zhuǎn)運(yùn)體以及各種代謝酶在依賴性中的作用已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。這種實(shí)驗(yàn)方法特異性高, 避免了受體拮抗劑特異性低的缺點(diǎn) ,可以“真實(shí)”地體現(xiàn)目的基因的活動(dòng)特性。但任何事物都有兩重性,有優(yōu)點(diǎn) ,也有缺點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通過基因改造造成了動(dòng)物先天的遺傳異常, 生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能會(huì)發(fā)生一些意想不到的變化, 況且一種基因敲除了,其它基因功能可能代償性增強(qiáng),這就為解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加了困難, 這也可能是在有些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上取得的結(jié)果與在正常動(dòng)物上用特異性拮抗劑取得的結(jié)果不一致的原因之一。目前正在發(fā)展中的條件性基因敲除技術(shù)可以在成年鼠使某一基因突變 , 從而避免了發(fā)育過程中的遺傳缺陷。相信在不久的將來(lái),隨著各種技術(shù)的成熟,利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究藥物依賴性的機(jī)制乃至篩選治療藥物都將得到進(jìn)一步發(fā)展 。