摘要：線粒體膜電位檢測試劑盒的原理是通過熒光探針JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變來反應線粒體膜電位的下降，從而作為細胞凋亡的早期指標，需要在-20 ℃避光保存線粒體膜電位檢測試劑盒，該試劑盒的使用次數是100T。線粒體膜電位檢測試劑盒實驗操作步驟涉及JC-1工作液的配置，陽性對照的設置，可用于懸浮細胞和貼壁細胞凋亡實驗檢測，以及純化的線粒體的檢測。

一，線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）包裝簡介：
產品貨號：CA1310
產品規(guī)格：100T
產品內容：（如表）

保存條件：
-20 ℃避光保存，盡量避免反復凍融，有效期一年。 超純水和JC-1 染色緩沖液（5 ×）也可4 ℃保存。
二，線粒體膜電位檢測試劑盒的原理：
    線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 ）是一種以JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細胞凋亡檢測。
    JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，可以產生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時 JC-1 為單體，可以產生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。
    線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。
    JC-1 單體的最大激發(fā)波長為 515nm ，最大發(fā)射波長為529nm ；JC-1 聚合物的最大激發(fā)波長為585nm ，最大發(fā)射波長為590nm 。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。
    本試劑盒提供了CCCP 作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200 個樣品。
三，實驗操作步驟：
1、JC-1染色工作液的配制：
六孔板每孔所需JC-1 染色工作液的量為 1mL ，其他培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100 萬細胞需0.5mL JC-1 染色工作液。取適量JC-1 （200×），按照每50μL JC-1（200×）加入 8mL 超純水的比例稀釋JC-1 。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1 。然后再加入2mL JC-1 染色緩沖液（5 ×），混勻后即為 JC-1 染色工作液。
2、陽性對照的設置：
    把試劑盒中提供的CCCP（10mM ）推薦按照1 ∶1000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10uM ，處理細胞 20 分鐘。隨后按照下述方法裝載 JC-1 ，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數細胞，通常10uM CCCP處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經JC-1 染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。
3、對于懸浮細胞：
（1）取 10～60 萬細胞，重懸于 0.5mL 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
（2）加入 0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育20 分鐘。
（3）在孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
（4）37℃孵育結束后，600g 4 ℃離心3 ～4 分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
（5）用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4 ℃離心3～4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4 ℃離心 3～4 分鐘，沉淀細胞，棄上清。
（6）再用適量 JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。
4、對于貼壁細胞：
    注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
（1）對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據具體實驗如有必要可以用PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL 細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
（2）加入 1mL JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20 分鐘。
（3）在孵育期間，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
（4）37℃孵育結束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。
（5）加入2mL 細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
（6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。
5、對于純化的線粒體：
（1）把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。
（2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為10 ～100 μg 純化的線粒體。
（3）用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan ），激發(fā)波長為 485nm ，發(fā)射波長為 590nm 。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為485nm 時，可以在475～520nm 范圍內設置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長設置進行熒光檢測。
（4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6 。
6、熒光觀測和結果分析：
    檢測JC-1 單體時可以把激發(fā)光設置為 490nm ，發(fā)射光設置為 530nm ；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設置為525nm ，發(fā)射光設置為590nm 。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察 GFP 或FITC 時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3 時的設置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。
四，實驗中的注意事項：
1. JC-1 （200×）在4 ℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
2. 必須先把JC-1（200×）用試劑盒提供的超純水充分溶解混勻后，才可以加入JC-1 染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1 染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1 會很難充分溶解，會嚴重影響后續(xù)的檢測。
3. 裝載完JC-1 后用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-1 染色緩沖液（1×）保持4 ℃左右，此時的洗滌效果較好。
4. JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在30 分鐘內完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。
5. 請勿把JC-1 染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1 染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1 染色緩沖液（5×）。
6. 如果發(fā)現(xiàn)JC-1 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。
7. CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。
8. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

      北京索萊寶科技有限公司（Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. ）是一家從事生物學試劑及試劑盒的高科技生物企業(yè)�？偛课挥诒本�，并在全國設有經銷或代理機構。產品因可靠而穩(wěn)定的質量和完善的售后服務確立了“Solarbio”良好的品牌形象。公司秉承“以客戶為中心、以產品為保障、以誠信為基礎、以創(chuàng)新為宗旨”的發(fā)展理念，擁有專業(yè)的研發(fā)和質量檢測團隊以及先進的倉儲和物流系統(tǒng)。“Solarbio”已經得到全國科研工作者的認可，成為廣大經銷商推崇的知名品牌。