中喬新舟從原代培養(yǎng)到建立永生細(xì)胞系的方法總結(jié)
原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。原代細(xì)胞是可以真實(shí)地反映特定細(xì)胞在體內(nèi)的生理狀態(tài)。但是它們一般傳了很少的代數(shù)就會(huì)停止增殖并死亡。對(duì)于一些需要大量細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)比如生化分解，遺傳篩選等，無(wú)法使用原代細(xì)胞。因此在體外建立永生細(xì)胞以研究細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和衰老是很重要的。本文簡(jiǎn)單介紹中喬新舟從原代培養(yǎng)到建立永生細(xì)胞系的方法。
三個(gè)方案可供選擇：
實(shí)驗(yàn)流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
許多病毒基因是可以影響細(xì)胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原來(lái)誘導(dǎo)永生化。SV40 T抗原已被大量細(xì)胞驗(yàn)證是細(xì)胞永生化最簡(jiǎn)單有效的試劑，其機(jī)制相對(duì)容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴腎細(xì)胞病毒，SV40編碼兩種腫瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分別為大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原為細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)所必需;②轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持必需要有大T抗原的連續(xù)表達(dá);③小T抗原對(duì)于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不是必需的，但可起加強(qiáng)作用。因此，SV40 Large T 能使細(xì)胞進(jìn)入永生化的增殖狀態(tài)，缺點(diǎn)是存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，可能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。(如中喬新舟：貨號(hào)：ZQ1099 名稱(chēng)是huvec-Immortalized人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-永生化的細(xì)胞等)。下圖是CV40基因組DNA的構(gòu)成元件和永生化的進(jìn)程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
端粒中含有一種逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉(zhuǎn)錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補(bǔ)端粒的長(zhǎng)度，使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)。然而，正常細(xì)胞中通常不表達(dá)TERT。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化，需要使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，將TERT轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。
Figure 2．端粒酶延長(zhǎng)的激活（圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因，與端粒酶活性呈現(xiàn)正相關(guān)。為了使原代細(xì)胞獲得永生化同時(shí)維持正常細(xì)胞的生理特性，我們將原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA（hTERT），從而激活端粒酶活性，維持端粒長(zhǎng)度，阻止染色體端粒降解，誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。在高傳代數(shù)和使用致癌基因時(shí)，hTERT永生化細(xì)胞忠實(shí)地代表了體內(nèi)正常細(xì)胞的生理特性。
方案三：復(fù)合型病毒感染介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
在某些細(xì)胞類(lèi)型中，僅使用一種永生化方法可能無(wú)法產(chǎn)生永生細(xì)胞，或者有些細(xì)胞不適合端粒酶介導(dǎo)的方法，因此，根據(jù)不同的細(xì)胞系，最好結(jié)合抑制細(xì)胞周期和hTERT的表達(dá)來(lái)永生更多的細(xì)胞。這就需要用到復(fù)合型病毒感染，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40T及hTERT基因，這種方法綜合了上述兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，可能既保持了原始特性，也避免核型發(fā)生變異。如：ZQY008人胰腺星狀細(xì)胞-永生化；ZQY009 人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞-永生化等細(xì)胞。
此外獲得永生化細(xì)胞的方法還有基因編輯技術(shù)，化學(xué)誘導(dǎo)，物理（穿刺）細(xì)胞等技術(shù)，中喬新舟原代細(xì)胞永生化均通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式單獨(dú)或者混合攜帶SV40T及hTERT基因來(lái)獲得。中喬新舟提供上百種人源及動(dòng)物源的永生化細(xì)胞株，以及上百種永生化細(xì)胞培養(yǎng)基供科研工作者選擇使用。
永生化細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域
1. 藥物篩選和開(kāi)發(fā)：永生化細(xì)胞是藥物篩選和毒性測(cè)試的理想模型。通過(guò)使用這些細(xì)胞，可以在實(shí)驗(yàn)室中快速、大規(guī)模地進(jìn)行藥物篩選，評(píng)估藥物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能驗(yàn)證：由于這些細(xì)胞能夠長(zhǎng)期增殖，它們成為了研究基因功能和細(xì)胞信號(hào)通路的重要工具，特別是在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、癌癥等領(lǐng)域。
3. 癌癥研究：許多永生化細(xì)胞系源于癌細(xì)胞，癌細(xì)胞的永生化特性使其成為研究癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療的關(guān)鍵模型，幫助科學(xué)家理解癌癥的生物學(xué)機(jī)制。
4. 抗體生產(chǎn)：永生化細(xì)胞，如CHO細(xì)胞，被廣泛用于單克隆抗體和重組蛋白的生產(chǎn)，這對(duì)于生物藥物的發(fā)展具有重要意義。
三個(gè)方案可供選擇：
實(shí)驗(yàn)流程如下：
方案一：SV40 LargeT 介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
許多病毒基因是可以影響細(xì)胞周期的，目前常用的方法是使用SV40 T抗原來(lái)誘導(dǎo)永生化。SV40 T抗原已被大量細(xì)胞驗(yàn)證是細(xì)胞永生化最簡(jiǎn)單有效的試劑，其機(jī)制相對(duì)容易理解。SV40（simian virus 40）是猿猴腎細(xì)胞病毒，SV40編碼兩種腫瘤抗原 (tumor antigen，T抗原)，分別為大T抗原和小T抗原。T抗原的作用是：①大T抗原為細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動(dòng)所必需;②轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型的維持必需要有大T抗原的連續(xù)表達(dá);③小T抗原對(duì)于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不是必需的，但可起加強(qiáng)作用。因此，SV40 Large T 能使細(xì)胞進(jìn)入永生化的增殖狀態(tài)，缺點(diǎn)是存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，可能引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。(如中喬新舟：貨號(hào)：ZQ1099 名稱(chēng)是huvec-Immortalized人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞-永生化的細(xì)胞等)。下圖是CV40基因組DNA的構(gòu)成元件和永生化的進(jìn)程：
Figure 1. (a) Structure of SV40 genomic DNA is composed of three elements: the early and late coding units and the regulatory region. (b) Several domains and motifs make up the SV40 T antigens. (c) A brief overview of the process of SV40 induced immortalized transformation. (Ahuja D,2005)
方案二：hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
端粒中含有一種逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT），它能催化作為模板的端粒酶反轉(zhuǎn)錄為端粒DNA，繼而合成到染色體末端，不斷彌補(bǔ)端粒的長(zhǎng)度，使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)。然而，正常細(xì)胞中通常不表達(dá)TERT。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞永生化，需要使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，將TERT轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。
Figure 2．端粒酶延長(zhǎng)的激活（圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)）
hTERT是人端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因，與端粒酶活性呈現(xiàn)正相關(guān)。為了使原代細(xì)胞獲得永生化同時(shí)維持正常細(xì)胞的生理特性，我們將原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA（hTERT），從而激活端粒酶活性，維持端粒長(zhǎng)度，阻止染色體端粒降解，誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。在高傳代數(shù)和使用致癌基因時(shí)，hTERT永生化細(xì)胞忠實(shí)地代表了體內(nèi)正常細(xì)胞的生理特性。
方案三：復(fù)合型病毒感染介導(dǎo)的永生化細(xì)胞
在某些細(xì)胞類(lèi)型中，僅使用一種永生化方法可能無(wú)法產(chǎn)生永生細(xì)胞，或者有些細(xì)胞不適合端粒酶介導(dǎo)的方法，因此，根據(jù)不同的細(xì)胞系，最好結(jié)合抑制細(xì)胞周期和hTERT的表達(dá)來(lái)永生更多的細(xì)胞。這就需要用到復(fù)合型病毒感染，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40T及hTERT基因，這種方法綜合了上述兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，可能既保持了原始特性，也避免核型發(fā)生變異。如：ZQY008人胰腺星狀細(xì)胞-永生化；ZQY009 人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞-永生化等細(xì)胞。
此外獲得永生化細(xì)胞的方法還有基因編輯技術(shù)，化學(xué)誘導(dǎo)，物理（穿刺）細(xì)胞等技術(shù)，中喬新舟原代細(xì)胞永生化均通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式單獨(dú)或者混合攜帶SV40T及hTERT基因來(lái)獲得。中喬新舟提供上百種人源及動(dòng)物源的永生化細(xì)胞株，以及上百種永生化細(xì)胞培養(yǎng)基供科研工作者選擇使用。
永生化細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域
1. 藥物篩選和開(kāi)發(fā)：永生化細(xì)胞是藥物篩選和毒性測(cè)試的理想模型。通過(guò)使用這些細(xì)胞，可以在實(shí)驗(yàn)室中快速、大規(guī)模地進(jìn)行藥物篩選，評(píng)估藥物的有效性和安全性。
2. 基因研究和功能驗(yàn)證：由于這些細(xì)胞能夠長(zhǎng)期增殖，它們成為了研究基因功能和細(xì)胞信號(hào)通路的重要工具，特別是在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期、癌癥等領(lǐng)域。
3. 癌癥研究：許多永生化細(xì)胞系源于癌細(xì)胞，癌細(xì)胞的永生化特性使其成為研究癌癥發(fā)生、發(fā)展及治療的關(guān)鍵模型，幫助科學(xué)家理解癌癥的生物學(xué)機(jī)制。
4. 抗體生產(chǎn)：永生化細(xì)胞，如CHO細(xì)胞，被廣泛用于單克隆抗體和重組蛋白的生產(chǎn)，這對(duì)于生物藥物的發(fā)展具有重要意義。
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