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貨號(hào) | 20119 | 存儲(chǔ)條件 | f/l |
規(guī)格 | 25 Tests | ||
Ex (nm) | 493 | Em (nm) | 517 |
分子量 | 溶劑 | ||
產(chǎn)品詳細(xì)介紹 |
我們的Cell Meter 活細(xì)胞胱天蛋白酶活性測(cè)定試劑盒基于胱天蛋白酶的熒光FMK抑制劑。 這些抑制劑是細(xì)胞可滲透的和無(wú)細(xì)胞毒性的。 一旦進(jìn)入細(xì)胞,胱天蛋白酶抑制劑就與活性胱天蛋白酶共價(jià)結(jié)合。 該Cell Meter 活細(xì)胞caspase 10活性測(cè)定試劑盒旨在通過(guò)測(cè)量活細(xì)胞中的caspase 10活化來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 它用于定量凋亡細(xì)胞中激活的caspase 10活性,或用于篩選caspase 10抑制劑。 FAM-VAD-FMK,綠色標(biāo)記試劑,可通過(guò)熒光顯微鏡,流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀直接檢測(cè)凋亡細(xì)胞中活化的胱天蛋白酶10。 該試劑盒為所有必需成分提供了優(yōu)化的測(cè)定方案。
分離細(xì)胞的檢測(cè)方案
概述
用密度為5×105到2×106個(gè)細(xì)胞/ mL的測(cè)試化合物制備細(xì)胞
將FAM-YVAD-FMK以1:150的比例加入到細(xì)胞溶液中
在室溫下孵育1小時(shí)
將細(xì)胞沉淀,用緩沖液或生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌并重懸細(xì)胞
在Ex / Em = 490 / 525nm處分析細(xì)胞
注:使用前將所有部件在室溫下解凍。
操作方法
1.根據(jù)您的特異性誘導(dǎo)方案,將細(xì)胞培養(yǎng)至最適于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的密度,但不超過(guò)2 x 106個(gè)細(xì)胞/ mL。同時(shí),對(duì)于每種標(biāo)記條件,以與誘導(dǎo)群體相同的密度培養(yǎng)非誘導(dǎo)的陰性對(duì)照細(xì)胞群。以下是一些誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的例子:
1)用2μg/ ml喜樹(shù)堿處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。
2)用1μM星形孢菌素處理Jurkat細(xì)胞3小時(shí)。
3)用4μg/ ml喜樹(shù)堿處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。
4)用1μM星形孢菌素處理HL-60細(xì)胞4小時(shí)。
注意:應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估,以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳細(xì)胞密度。
2.通過(guò)向FAM-YVAD-FMK(組分A)的小瓶中加入50μLDMSO制備150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液。
3.將150×FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液(來(lái)自步驟1)以1:150的比例添加到細(xì)胞溶液中,并將細(xì)胞在37℃,5%CO 2培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。
注1:對(duì)于FAM-YVAD-FMK標(biāo)記,細(xì)胞可以濃縮至~5×10 6個(gè)細(xì)胞/ mL。 未使用的150X FAM-YVAD-FMK DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20°C。
注2:對(duì)于粘附細(xì)胞,用0.5mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整,并在用FAM-YVAD-FMK孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。
注3:適當(dāng)?shù)姆跤龝r(shí)間取決于所用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。 優(yōu)化每個(gè)實(shí)驗(yàn)的孵育時(shí)間。
4.將細(xì)胞以約200g旋轉(zhuǎn)5分鐘,并用1mL洗滌緩沖液(組分B)洗滌細(xì)胞兩次。 將細(xì)胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。
注1:FAM-YVAD-FMK是熒光的,因此清除任何未結(jié)合的試劑以消除背景非常重要。
注2:對(duì)于分離的細(xì)胞,應(yīng)將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至每個(gè)微量滴定板孔中2-5×10 5個(gè)細(xì)胞/100μL等分試樣,用于步驟6。
5.如果需要,用DNA染色標(biāo)記細(xì)胞(如用于死細(xì)胞的碘化丙錠,或用于細(xì)胞核染色的整個(gè)群體的Hoechst)。
6.通過(guò)熒光顯微鏡,流式細(xì)胞儀或熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 490 / 525nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度(對(duì)于碘化丙錠,Ex / Em = 535/635 nm;對(duì)于Hoechst染料,Ex / Em = 350 / 461納米)。
6.1對(duì)于流式細(xì)胞儀,使用FL1通道監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度(FL2通道用于碘化丙錠染色)。
6.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀。將100μL細(xì)胞懸浮液置于96孔黑壁/微量滴定板透明底部的每個(gè)孔中。
注意:如果需要平衡細(xì)胞濃度,調(diào)整誘導(dǎo)細(xì)胞的懸浮體積以接近非誘導(dǎo)細(xì)胞群的細(xì)胞密度。如果您的細(xì)胞治療不會(huì)導(dǎo)致受刺激細(xì)胞群數(shù)量的顯著損失,則此調(diào)整步驟是可選的。
6.3使用FITC通道在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞(用于碘化丙啶染色的TRITC通道,用于Hoechst染色的DAPI通道)。
6.4使用熒光酶標(biāo)儀,使用Ex / Em = 490 / 525nm(在515nm處截止)底部讀取模式監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。