α-淀粉酶檢測(cè)試劑盒(CERALPHA METHOD)K-CERA使用說(shuō)明書
α-淀粉酶檢測(cè)試劑盒(CERALPHA METHOD)K-CERA
每個(gè)試劑盒100/200 次檢測(cè)
引言
每個(gè)試劑盒100/200 次檢測(cè)
AOAC方法2002.01
AACC方法22-02.01
ICC 標(biāo)準(zhǔn) No. 303
引言
微生物α-淀粉酶在谷物制品中淀粉的改性以及谷物加工中應(yīng)用廣泛。 微生物α-淀粉酶在谷物制品中淀粉的改性以及谷物加工中應(yīng)用廣泛。谷物及其制品中內(nèi)源性α-淀粉酶的水平對(duì)這些商品的工業(yè)利用具有顯著影響。在面包制作中，α-淀粉酶的水平必須足夠產(chǎn)生可被酵母吸收和利用的糖類，但又不能過(guò)高，否則會(huì)導(dǎo)致淀粉過(guò)度糊精化，從而引起面包內(nèi)部粘稠和加工問(wèn)題。在釀造行業(yè)，麥芽α-淀粉酶的水平是一個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù)。α-淀粉酶還作為青貯飼料添加劑使用，以幫助分解淀粉，從而為細(xì)菌生長(zhǎng)提供可發(fā)酵的糖類。細(xì)菌、真菌和谷物α-淀粉酶都可以使用淀粉酶 HR 試劑進(jìn)行測(cè)定，但測(cè)定條件（特別是 pH 值）需要根據(jù)每種特定酶進(jìn)行調(diào)整。淀粉酶 HR 試劑專用于α-淀粉酶。該底物絕對(duì)抵抗外切酶（如β-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶）的水解。
原理：
Ceralpha 法（使用淀粉酶 HR 試劑）測(cè)定α-淀粉酶的程序，采用“非還原端阻斷的對(duì)硝基苯基麥芽庚糖苷”（BPNPG7）作為底物，在過(guò)量的耐熱α-葡萄糖苷酶（由于“阻斷基團(tuán)”的存在，該酶對(duì)天然底物無(wú)作用）存在的情況下進(jìn)行。內(nèi)切作用的α-淀粉酶水解寡糖后，混合物中過(guò)量的α-葡萄糖苷酶會(huì)立即將對(duì)硝基苯基麥芽糖苷片段定量水解為葡萄糖和游離對(duì)硝基苯酚。測(cè)定格式見“測(cè)定原理”（第 17 頁(yè)），測(cè)定的線性關(guān)系見圖 1（第 11 頁(yè)）。本質(zhì)上，將谷物面粉提取
物或發(fā)酵液的樣品在特定條件下與底物混合物孵育，然后通過(guò)加入弱堿溶液終止反應(yīng)（并顯色）。在 400 nm 處測(cè)量吸光度（以前的文獻(xiàn)值為 410 nm，但實(shí)際吸收峰在 400 nm）（見第 12 頁(yè)，圖 4），該吸光度與樣品中α-淀粉酶的水平直接相關(guān)。
淀粉酶 HR 試劑混合物可用于定量測(cè)定谷物、真菌和細(xì)菌α-淀粉酶。用耐熱α-葡萄糖苷酶替代原始 Ceralpha 試劑混合物中的淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶后，該測(cè)定法現(xiàn)在可以在更寬的 pH 范圍（5.2 至 7.0）和高達(dá) 60°C 的溫度下使用。使用這種新試劑，谷物α-淀粉酶的最佳活性 pH 為 5.2-5.4（見圖 7，第16 頁(yè)）。此外，在此 pH 范圍內(nèi)，使用淀粉酶 HR 試劑測(cè)得的谷物α-淀粉酶活性值與使用 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶）在 pH 5.2 測(cè)得的活性值基本相同。使用阻斷對(duì)硝基苯基麥芽庚糖苷作為底物的試劑混合物無(wú)法區(qū)分真菌、谷物和細(xì)菌來(lái)源的α-淀粉酶。
準(zhǔn)確性：
專一性：
準(zhǔn)確性：
標(biāo)準(zhǔn)誤差通常小于 5%。
試劑盒組成：
適用于進(jìn)行 100/200 次檢測(cè)的試劑盒由 Megazyme 提供，包括：
1. 完整的測(cè)定方法
2. 凍干的 BPNPG7 和耐熱α-葡萄糖苷酶
3. 濃縮提取緩沖液
4. 濃縮終止試劑
5. 標(biāo)準(zhǔn)麥芽粉
專一性：
該方法對(duì)α-淀粉酶具有絕對(duì)特異性
表 1： Ceralpha 法測(cè)定小麥粉α-淀粉酶的重復(fù)性
表 1： Ceralpha 法測(cè)定小麥粉α-淀粉酶的重復(fù)性
a 分別在四天內(nèi)對(duì)單一提取物進(jìn)行重復(fù)分析。b基于對(duì)每個(gè)樣本均值方差的匯總估計(jì)。單個(gè)觀測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)差(用于比較同一天和不同天)=0.189
c.v.(%)=4.05。
c.v.(%)=4.05。
附帶的底物：
阻斷對(duì)硝基苯基麥芽庚糖苷（BPNPG7，54.5mg）
熱穩(wěn)定α-葡萄糖苷酶(pH 6.0 時(shí)為 125U),每瓶。
將一瓶的全部?jī)?nèi)容物溶于 10.0 mL 蒸餾水中, 等分為 2-3mL，冷凍儲(chǔ)存。在 0-5°C 時(shí),溶解的底物可穩(wěn)定保存 7 天；冷凍狀態(tài)下可穩(wěn)定保存至少 12 個(gè)月。
附帶的麥芽粉：
標(biāo)準(zhǔn)化α-淀粉酶活性的麥芽粉(如小瓶標(biāo)簽上所注明)
建議用戶至少標(biāo)準(zhǔn)化一批自己的小麥粉或麥芽粉，作為二級(jí)質(zhì)控樣參考。
建議用戶至少標(biāo)準(zhǔn)化一批自己的小麥粉或麥芽粉，作為二級(jí)質(zhì)控樣參考。
附帶的溶液：
(1)濃縮提取緩沖液：
1 M 蘋果酸（Buffer A）
1 M 氯化鈉
40 mM 氯化鈣
0.1%疊氮化鈉
將全部?jī)?nèi)容物（50 mL）（以及可能出現(xiàn)的結(jié)晶沉淀）稀釋至 1000 mL 蒸餾水中后使用。在 0-5°C 下可穩(wěn)定保存 12 個(gè)月。pH 應(yīng)為 5.4；如有必要請(qǐng)調(diào)整。
(2)濃縮終止試劑：
(20%[w/v]磷酸三鈉 溶液，pH 約為 11)用蒸餾水將全部?jī)?nèi)容物(25mL)稀釋至 500 mL，室溫下可穩(wěn)定保存 3 個(gè)月。
額外提取緩沖液的制備：
A. 緩沖液 A（用于谷物和真菌α-淀粉酶）：
蘋果酸(Sigma M0875; 1 M) 134.1g/L
氫氧化鈉 70 g/L
氯化鈉 58.4 g/L
二水氯化鈣 (40mM) 5.9 g/L
疊氮化鈉(Sigma S2002; 0.1 % ) 1.0 g/L
將蘋果酸、氯化鈉和氫氧化鈉加入 800 mL 蒸餾水中，冷卻至室溫后加入氯化鈣。通過(guò)逐滴加入氫氧化鈉（4 M）或鹽酸（4 M）將 pH 調(diào)整至 5.4，然后加入疊氮化鈉。調(diào)整體積至 1 L。儲(chǔ)存于室溫。使用時(shí)，將 50 mL 濃縮緩沖液稀釋至 1 L。
注意
在加入疊氮化鈉之前，先將試劑溶解并調(diào)整 pH 至 5.4。將疊氮化鈉加入酸性溶液中會(huì)產(chǎn)生有毒氣體。蘋果酸和富馬酸粉末具有刺激性，應(yīng)小心處理。
B. 緩沖液 B（用于芽孢桿菌屬α-淀粉酶）：
馬來(lái)酸(Sigma M0375; 0.1 M) 23.2g/2L
氯化鈉 11.6 g/2L
二水氯化鈣(2mM) 0.6 g/2L
疊氮化鈉(Sigma S2002;0.01%w/v) 0.2 g/2L
將馬來(lái)酸和氯化鈉加入 1600mL 蒸餾水中，用 4M(160g/L)氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 至6.5。加入氯化鈣和疊氮化鈉，調(diào)節(jié)體積至 2L。儲(chǔ)存于室溫。
直接使用此緩沖液，無(wú)需進(jìn)一步稀釋。
直接使用此緩沖液，無(wú)需進(jìn)一步稀釋。
一些細(xì)菌α-淀粉酶在稀釋后不穩(wěn)定。通常通過(guò)在緩沖液中加入 BSA(0.5mg/mL)
來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。
額外終止試劑的制備：
將 10 克磷酸三鈉(無(wú)水)溶解在 1L 蒸餾水中，調(diào)整 pH 至約 11.0。在室溫下可穩(wěn)定保存至少 3 個(gè)月。
設(shè)備(推薦):
1. 玻璃試管(12mL 和 20mL 容量 ) 。
2. 移液器，0.1 和/或 0.2mL (例如：Gilson Pipetman®）來(lái)分配酶提取液和底物。
3. 可調(diào)容積分配器：
- 0-10mL (用于提取緩沖液)。
- 0-5mL (用于終止試劑)。
4. 正位移移液器，例如 Eppendorf Multipette®
- 配備 5.0mL Combitip®(用于分配 0.5 mL 的濃縮酶溶液)。
- 配備 25 mL Combitip®（用于分配各種體積的稀釋緩沖液）。
5. 托盤天平
6. 設(shè)定在 400 nm 的分光光度計(jì)。
7. 渦旋混合器(可選)。
8. 恒溫水浴，設(shè)定在 40℃。
9. 秒表。
10. 臺(tái)式離心機(jī)或 Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙圓片（直徑 9 cm）。
控制與預(yù)防措施：
1. α-淀粉酶是所有體液中含量較高的酶。因此，建議在處理和分配底物混合物時(shí)使用一次性手套。
2. 溶解 Ceralpha 底物混合物所用的水必須是高純度的。如果沒有新鮮蒸餾水，可將水煮沸后冷卻至低于 30°C 再使用。洗瓶中的藻類生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生足夠的α-淀粉酶，顯著降低溶解在這種水中試劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
3. 凍干底物在室溫下非常穩(wěn)定，但溶解后在使用期間應(yīng)于 0-5°C 保存，不使用時(shí)應(yīng)低于-10°C 保存。如果一次測(cè)定的樣本數(shù)量有限，建議將底物分成 2-3mL 的等分，冷凍保存。
4. 在 0-5°C 下保存時(shí)，空白吸光度值會(huì)在 5 天內(nèi)從 0.03 增加到約 0.05。這不會(huì)影響底物的性能，但顯然這些值必須在測(cè)定進(jìn)行時(shí)同時(shí)確定。即使空白吸光度值高達(dá) 0.50，也不會(huì)影響測(cè)定的可靠性和準(zhǔn)確性。
注意：
對(duì)于每批被分析的樣品，通常只需一個(gè)反應(yīng)空白。 要獲得此空白值，將 3.0 mL終止試劑加入 0.2 mL 底物溶液中，然后加入 0.2 mL 酶制劑。
5. 所用的分光光度計(jì)應(yīng)使用對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)液在 1%磷酸三鈉中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（εmM = 18.1）。對(duì)硝基苯酚溶液（10 mM）可從 Sigma Chemical Company獲得（產(chǎn)品編號(hào) N7660）。將該溶液稀釋 200 倍后，在 1%磷酸三鈉中于400 nm 處的吸光度為 0.905。
6. 測(cè)定時(shí)應(yīng)使用附帶的麥芽粉標(biāo)準(zhǔn)樣。該面粉的酶活性顯示在附帶的標(biāo)簽上。
7. 小麥粉的提取時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在 15-20 分鐘。對(duì)于麥芽粉樣品，最佳提取時(shí)間也是 15-20 分鐘。
有用的提示：
1. 如果某個(gè)特殊測(cè)定的吸光度值大于 1.20，酶提取液應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并重新測(cè)定。
液體制劑：
分析程序：
2. 如果將所有試劑的體積減半，并使用半微量分光光度計(jì)比色皿，則試劑盒可
進(jìn)行的測(cè)定次數(shù)可增加一倍。
酶提�。�
A. 小麥和大麥面粉：
1. 將小麥、大麥或其他谷物（約 10-50 g 樣品）磨碎至通過(guò) 0.5 mm 篩（例如使
用 Fritsch 離心磨） 。
2. 準(zhǔn)確稱取 3.0 g 面粉，放入 50 mL 容量的燒瓶中。
3. 向每個(gè)燒瓶中加入 20.0 mL 提取緩沖液（pH 5.4），并劇烈攪拌燒瓶?jī)?nèi)容物。
4. 在 40°C 下提取酶 15-20 分鐘，期間偶爾攪拌。
5. 通過(guò) Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙過(guò)濾部分溶液，或以 1,000 g 離心 10 分鐘。在 2 小時(shí)內(nèi)測(cè)定酶活性。
B. 麥芽粉：
1. 將麥芽（20 g 樣品）磨碎至通過(guò) 0.5 mm 篩。
2. 準(zhǔn)確稱取 0.5 g 麥芽粉，放入 100 mL 容量瓶中。
3. 向容量瓶中加入 1%氯化鈉、0.02%氯化鈣和 0.02%疊氮化鈉的溶液，并調(diào)整體積。
4. 在室溫下提取酶 15-20 分鐘，期間偶爾攪拌。
5. 通過(guò) Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙過(guò)濾部分溶液，或以 1,000 g 離心 10 分鐘。
6. 用提取緩沖液稀釋 0.5 mL 濾液至 9.5 mL。在 2 小時(shí)內(nèi)測(cè)定酶活性（見第 6頁(yè) A 部分第 5 點(diǎn)）。
C. 微生物制劑：
液體制劑：
1. 使用正位移分配器，將 1 mL 液體酶制劑加入 49 mL 緩沖液 A 或 B（pH 5.4或 6.5）中，充分混合。這稱為原始提取液。
2. 取 1.0 mL 原始提取液，加入 9.0 mL 適當(dāng)?shù)木彌_液（A 或 B）中，充分混合。重復(fù)此步驟，直至獲得適合測(cè)定的稀釋度。例如，對(duì)于工業(yè)酶制劑（如愛爾蘭 Kerry Ingredients 的細(xì)菌α-淀粉酶），原始提取液需稀釋約 4,000 倍。
粉末制劑：
1. 將 1g 酶粉制劑加入 50mL 的緩沖液 A 或 B(pH 5.4 或 6.5)中，輕輕攪拌約 15分鐘，直至樣品完全分散或溶解。2. 通過(guò)離心(1000 g，10 分鐘)或 WhatmanNo.1（直徑 9 cm）濾紙過(guò)濾澄清該溶液（即原始提取液）。3. 取 1.0 mL 該溶液，加入 9.0 mL 適當(dāng)?shù)奶崛?稀釋緩沖液中，充分混合。重復(fù)此步驟，直至獲得適合測(cè)定的稀釋度。
分析程序：
A. 小麥和大麥面粉：
1. 將 0.2mL 的淀粉酶 HR 試劑溶液(未緩沖)分配到試管中，并將試管及內(nèi)容物在 40°C 下預(yù)孵育 5 分鐘。
2. 將谷物提取液在 40°C 下預(yù)孵育 5 分鐘。
3. 向每個(gè)含有 0.2 mL 淀粉酶 HR 試劑溶液的試管中，直接在試管底部加入 0.2mL 預(yù)平衡的小麥或大麥提取液。在 40°C 下孵育 20 分鐘（從加入時(shí)間開始計(jì)時(shí)）。
4. 在 20 分鐘孵育期結(jié)束后，準(zhǔn)確加入 3.0 mL 終止試劑，并劇烈攪拌試管內(nèi)容
物。
5. 在 400 nm 處讀取溶液和反應(yīng)空白的吸光度，以蒸餾水為對(duì)照。
B. 麥芽和微生物制劑：
1. 將 0.2mL 的淀粉酶 HR 試劑溶液(未緩沖)分配到試管中，并將試管及內(nèi)容物在 40°C 下預(yù)孵育 5 分鐘。
2. 將緩沖后的麥芽或微生物制劑提取液在 40°C 下預(yù)孵育 5 分鐘。
3. 向每個(gè)含有 0.2 mL 淀粉酶 HR 試劑溶液的試管中，直接在試管底部加入 0.2mL 預(yù)平衡（并適當(dāng)稀釋）的微生物酶或麥芽提取液。在 40°C 下孵育 10 分鐘（從加入時(shí)間開始計(jì)時(shí)）。
4. 在 10 分鐘孵育期結(jié)束后，準(zhǔn)確加入 3.0 mL 終止試劑，并劇烈攪拌試管內(nèi)容物。
5. 在 400 nm 處讀取溶液和反應(yīng)空白的吸光度，以蒸餾水為對(duì)照。
酶活計(jì)算：
一個(gè)活性單位定義為在過(guò)量耐熱α-葡萄糖苷酶存在的情況下，每分鐘從BPNPG7 釋放一微摩爾對(duì)硝基苯酚所需的酶量，稱為 Ceralpha 單位（CU）。單位/克面粉：
其中：
ΔA400
=反應(yīng)吸光度−空白吸光度
孵育時(shí)間
=麥芽和微生物制劑提取液：10 分鐘
=小麥和大麥提取液：20 分鐘
比色皿中的總體積 =3.4 mL
測(cè)定的樣品體積
=0.2 mL
對(duì)硝基苯酚在 1%磷酸三鈉中的摩爾吸光系數(shù)εmM（在 400 nm 處）= 18.1
提取體積=
小麥和大麥：每 3 克 20 mL
麥芽：每 0.5 克 100 mL
微生物制劑：每 1 克或 1 mL 50 mL
稀釋倍數(shù)
=原始提取液的稀釋倍數(shù)（麥芽提取液為 20 倍）
因此：
A. 對(duì)于小麥和大麥：
單位(CU)/克面粉：
單位(CU)/克面粉：
B. 對(duì)于麥芽：
單位(CU)/克磨碎麥芽：
C. 對(duì)于微生物制劑：
單位(CU)/ mL 或 g 原始制劑：
其中：
ΔA400
=反應(yīng)吸光度−空白吸光度
孵育時(shí)間=10 分鐘
比色皿中的總體積 =3.4 mL
測(cè)定的樣品體積=0.2 mL
對(duì)硝基苯酚在 1%磷酸三鈉中的摩爾吸光系數(shù)εmM（在 400 nm 處）= 18.1
提取體積=每 1 克 50 mL (或 49 mL 加 1 mL 濃縮酶液)
稀釋倍數(shù)=原始提取液的稀釋倍數(shù)
附錄：
A. Ceralpha 測(cè)定法與酶濃度和孵育時(shí)間的線性關(guān)系
圖 1. Ceralpha 測(cè)定法與麥芽α-淀粉酶在蘋果酸鈉緩沖液（pH 5.4）中的線性關(guān)系。測(cè)定使用了四種濃度的酶（1 倍、2 倍、3 倍和 4 倍）。反應(yīng)通過(guò)加入磷酸三鈉（3.0 mL，1% w/v）在不同時(shí)間終止。
B.耐熱α-葡萄糖苷酶濃度對(duì)測(cè)定的α-淀粉酶值的影響
從圖 2 的結(jié)果可以看出，底物溶液中飽和反應(yīng)所需的α-葡萄糖苷酶濃度為 12U/mL。
圖 2. 耐熱α-葡萄糖苷酶在底物試劑溶液中的濃度對(duì)測(cè)定吸光度值的影響。
將試劑的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘，冷卻至室溫后用于在 40°C 下測(cè)定真菌α-淀粉酶。
從圖 2 的結(jié)果可以看出，底物溶液中飽和反應(yīng)所需的α-葡萄糖苷酶濃度為 12U/mL。
圖 2. 耐熱α-葡萄糖苷酶在底物試劑溶液中的濃度對(duì)測(cè)定吸光度值的影響。
C. 試劑混合物在 60℃下的穩(wěn)定性。
通過(guò)將試劑溶液的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘來(lái)確定試劑溶液的穩(wěn)定性。這些溶液隨后用于測(cè)定真菌α-淀粉酶的活性（在 40°C 下進(jìn)行）。從圖 3 的數(shù)據(jù)可以看出，該試劑在 60°C 下非常穩(wěn)定。在 20 分鐘的孵育期內(nèi)，空白吸光度值增加了不到 0.01 吸光度單位，測(cè)定的活性下降不到 3%（與未預(yù)孵育的試劑相比）。
圖 3. 淀粉酶 HR 測(cè)定試劑在 60°C 下的溫度穩(wěn)定性。
將試劑的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘，冷卻至室溫后用于在 40°C 下測(cè)定真菌α-淀粉酶。
D. 以淀粉為底物，Ceralpha 單位（CU）與國(guó)際單位（IU）的換算
使用淀粉酶 HR 試劑和 ACS 可溶性淀粉（1% w/v；使用 Nelson-Somogyi 還原糖法測(cè)定；國(guó)際單位）測(cè)定了純枯草芽孢桿菌、黑曲霉和大麥麥芽α-淀粉酶的活性，換算因子如下：
黑曲霉（兩種測(cè)定均在 pH 5.4 下進(jìn)行）
以淀粉為底物，IU=0.94×CU
枯草芽孢桿菌（兩種測(cè)定均在 pH6.5 下進(jìn)行)
以淀粉為底物，IU=4.6×CU
大麥麥芽（兩種測(cè)定均在 pH 5.4 下進(jìn)行）
以淀粉為底物，IU=4.1×CU
一個(gè)酶活國(guó)際單位 （IU） 的定義是：在溫度和 pH 值確定的條件下 ，每分鐘
釋放一微摩爾葡萄糖還原糖當(dāng)量所需的酶量。
E. Ceralpha 法和 Farrand 法測(cè)定小麥和真菌α-淀粉酶的比較。
Farrand 法使用淀粉的β-極限糊精作為底物，通過(guò)測(cè)量淀粉/碘絡(luò)合物在底物降解時(shí)顏色的減少來(lái)測(cè)定。測(cè)定在過(guò)量的β-淀粉酶存在下進(jìn)行，對(duì)于谷物樣品，β-淀粉酶來(lái)自面粉提取液；對(duì)于真菌樣品，需要添加純β-淀粉酶。Farrand 法曾在英國(guó) 廣泛使 用， 并使用 Rank Hovis 公司 提供的 β- 極限 糊精。 [Megazyme International 現(xiàn)提供一種純化的β-極限糊精（已去除麥芽糖）。] 在標(biāo)準(zhǔn) Farrand法中，提取液未緩沖，面粉提取液的 pH 約為 5.8。
在 Campden-Chorleywood 食品研究協(xié)會(huì)協(xié)調(diào)的 Farrand 法和 Ceralpha 法的實(shí)驗(yàn)室間比較中，小麥面粉α-淀粉酶的 Farrand 單位與 Ceralpha 單位的相關(guān)性為：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57 - 1.9
一個(gè)國(guó)際單位（IU）的酶活定義為在特定的溫度和 pH 條件下，每分鐘釋放一微摩爾葡萄糖還原糖當(dāng)量所需的酶量。
McCleary 和 Sheehan（McCleary and Sheehan，1987）曾報(bào)告過(guò)類似的相關(guān)性：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57.1
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57.1
對(duì)于真菌樣品，McCleary 等人得到的回歸方程為：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位×69
在添加了真菌α-淀粉酶的小麥面粉中測(cè)定α-淀粉酶時(shí)，由于兩種組分混合的問(wèn)題（其中一種組分的酶含量很低，另一種組分的酶含量比第一種組分高數(shù)千倍），可能會(huì)出現(xiàn)誤差。為了盡量減少可能由于這兩種組分混合不完全而導(dǎo)致的誤差，應(yīng)進(jìn)行雙份樣品測(cè)定，并提取較大樣品（約 6 g/40 mL）。
F. Ceralpha 法（CU）、ASBC 法（DU）與 AACC 法 22-01（SKB 單位）
測(cè)定α-淀粉酶的比較
AACC 法 22-01（SKB 單位）使用一種由 AACC/ASBC 提供的“特殊”林特納淀粉制備的β-極限糊精。該方法通過(guò)測(cè)量α-淀粉酶在 30°C 下與β-極限糊精孵育時(shí)達(dá)到特定碘色的時(shí)間來(lái)測(cè)定。
ASBC/EBC/國(guó)際法（糊精化單位，DU）使用與 AACC 法 22-01 相同的底物和相同的酶濃度，活性單位的計(jì)算方式也相同。然而，由于該測(cè)定在 20°C 下進(jìn)行，因此對(duì)于特定麥芽樣品，DU 值大約是同一麥芽樣品 SKB 值的一半。AACC 方法 22-01(SKB 單位)和麥芽粉 Ceralpha 單位(CU)之間的關(guān)系如圖 5 所示。α-淀粉酶(DU)的 ASBC(國(guó)際方法)和 Ceralpha 方法(CU)之間的關(guān)系如圖 6 所示。
圖 5. Ceralpha 法和 AACC 法 22-01（SKB）測(cè)定麥芽粉中α-淀粉酶的相關(guān)性用兩種方法對(duì) 7 份麥芽樣品進(jìn)行重復(fù)分析。
圖 6 Ceralpha 法和 ASBC（國(guó)際法）測(cè)定麥芽粉中α-淀粉酶的相關(guān)性。用兩種方法對(duì) 7 份麥芽樣品進(jìn)行重復(fù)分析。
麥芽、真菌和細(xì)菌 a-淀粉酶的 SKB 單位與 Ceralpha 單位的換算系數(shù)如下：
麥芽α-淀粉酶：
SKB 單位=0.42×Ceralpha 單位(CU)-0.34。
（SKB 在 pH 4.7 下進(jìn)行；Ceralpha 在 pH 5.4 下進(jìn)行）。
真菌α-淀粉酶：
SKB 單位 = 0.60 x Cera lpha 單位(CU ) 。
(SKB 在 pH 5.4 下進(jìn)行；Ceralpha 在 pH 5.4 下進(jìn)行)。
細(xì)菌α-淀粉酶：
SKB 單位 = 1.8 x Ceralpha 單位(CU ) 。
（SKB 在 pH 6.5 下進(jìn)行；Ceralpha p 在 pH 6.5 進(jìn)行。
G. 谷物、真菌和細(xì)菌α-淀粉酶 在不同 pH 值下的活力曲線
使用 Ceralpha 法和淀粉酶 HR 試劑測(cè)定了小麥麥芽、大麥麥芽、真菌（黑曲霉）和細(xì)菌（枯草芽孢桿菌）α-淀粉酶的 pH 活性曲線。對(duì)于谷物和真菌α-淀粉酶，使用蘋果酸和富馬酸緩沖液（100 mM，pH 5.0-6.4）制備 pH 曲線；對(duì)于細(xì)菌α-淀粉酶，使用富馬酸和 Bis-Tris 丙烷緩沖液（pH 5.6-9.0）。所有緩沖液均含有10 mM 氯化鈣。純化的小麥麥芽和真菌α-淀粉酶的曲線如圖 7 所示。大麥麥芽α-淀粉酶的曲線與小麥麥芽相同�？莶菅挎邨U菌α-淀粉酶的 pH 活性曲線如圖 8所示。
真菌α-淀粉酶使用淀粉酶 HR 試劑和 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶）進(jìn)行測(cè)定，兩條曲線相同。
使用 Ceralpha 法和淀粉酶 HR 試劑測(cè)定了小麥麥芽、大麥麥芽、真菌（黑曲霉）和細(xì)菌（枯草芽孢桿菌）α-淀粉酶的 pH 活性曲線。對(duì)于谷物和真菌α-淀粉酶，使用蘋果酸和富馬酸緩沖液（100 mM，pH 5.0-6.4）制備 pH 曲線；對(duì)于細(xì)菌α-淀粉酶，使用富馬酸和 Bis-Tris 丙烷緩沖液（pH 5.6-9.0）。所有緩沖液均含有10 mM 氯化鈣。純化的小麥麥芽和真菌α-淀粉酶的曲線如圖 7 所示。大麥麥芽α-淀粉酶的曲線與小麥麥芽相同�？莶菅挎邨U菌α-淀粉酶的 pH 活性曲線如圖 8所示。
真菌α-淀粉酶使用淀粉酶 HR 試劑和 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶）進(jìn)行測(cè)定，兩條曲線相同。
標(biāo)簽：
α-淀粉酶檢測(cè)
K-CERA
- 尚睿生物推出粉絲等植物源性成分qPCR檢測(cè)試劑盒
- 武漢英科生物推出粉絲中物源性成分檢測(cè)試劑盒
- 中檢葆泰精彩亮相中國(guó)乳制品工業(yè)協(xié)會(huì)第三十次年會(huì)
- 普瑞邦邀您參展谷物糧油檢測(cè)與質(zhì)量控制技術(shù)交流會(huì)
- 講座開播：常見毒蘑菇識(shí)別及毒素檢測(cè)新技術(shù)
- 直播預(yù)告：野生菌上新季助你采菌不采雷
- 普瑞邦邀您云逛展：現(xiàn)場(chǎng)直播食品過(guò)敏原快速檢測(cè)課堂
- 普瑞邦新品：花生過(guò)敏原環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增LAMP試劑盒
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：[email protected]