總膳食纖維檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
簡(jiǎn)介：
膳食纖維是一種復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)的混合物，包括親水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角質(zhì)、樹(shù)莓和木脂素。本手冊(cè)中概述的總膳食纖維測(cè)定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纖維試劑盒中的酶也可用于其他膳食纖維分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（總膳食纖維）：
總膳食纖維（TDF）是在干燥和脫脂（如果脂肪含量大于10%）材料的復(fù)樣上測(cè)定的。樣品在~100°C下用熱穩(wěn)定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝膠化、水解和解聚；在60°C下與蛋白酶（溶解和解聚蛋白質(zhì)）和淀粉葡萄糖苷酶（將淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培養(yǎng)；用四體積乙醇沉淀可溶性纖維，去除淀粉中解聚的蛋白質(zhì)和葡萄糖。過(guò)濾殘留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗滌；干燥；稱重。對(duì)一份樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，另一份在525°C下培養(yǎng)以測(cè)定灰分。TDF是過(guò)濾和干燥殘?jiān)闹亓繙p去蛋白質(zhì)和灰分的重量。
Megazyme-TDF檢測(cè)試劑盒的主要優(yōu)點(diǎn)是它含有高純度、無(wú)干擾活性的酶，并且酶的活性是標(biāo)準(zhǔn)化的。標(biāo)準(zhǔn)化α-淀粉酶活性在抗性淀粉測(cè)定中的重要性已得到公認(rèn)。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纖維素酶，而其他常用制劑含有嚴(yán)重的這種活性污染，導(dǎo)致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、穩(wěn)定的液態(tài)形式供應(yīng)。
范圍：
適用于谷類、果蔬、谷類水果制品及食品。
酶純度和標(biāo)準(zhǔn)化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推薦的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和純度。Megazyme耐熱α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性為3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供應(yīng)濃度為50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供應(yīng)濃度為200 U/mL（對(duì)硝基苯基β-麥芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。這種淀粉葡萄糖苷酶活性是傳統(tǒng)TDF分析中所用濃度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纖維素酶，而在用于TDF測(cè)定的其他制劑中，纖維素酶污染可高達(dá)淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性計(jì)）。這種程度的污染導(dǎo)致β-葡聚糖的低估率高達(dá)10-15%。
巨酵素酶的測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)化方法可根據(jù)要求提供。
TDF檢測(cè)試劑盒：
Megazyme提供100/200分析試劑盒，其中包含完整的分析方法以及：
100測(cè)定試劑盒（cat。不。K-TDFR-100A）
200測(cè)定試劑盒（cat。不。K-TDFR-200A）
瓶子3：（x 2）純化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。編號(hào)：E-AMGDF）。
分析級(jí)硅藻土，100 g或500 g包裝，可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)（類別。編號(hào)G-CEL-100G或cat。編號(hào)G-CEL-500G）。®
TDF檢測(cè)對(duì)照試劑盒（）：K-TDFC公司
該試劑盒與TDF分析試劑盒一起使用，以確定酶的有效性和純度。該試劑盒包含下列每種成分的一小瓶和一份技術(shù)數(shù)據(jù)表（K-TDFC；膳食纖維對(duì)照品）。
該試劑盒中包含的每種成分的量足以進(jìn)行至少10次分析。
方法1：
總、可溶性和不溶性膳食纖維的測(cè)定
根據(jù)AOAC方法991.43“總、可溶和不溶
《食品中的膳食纖維》（1991年第一次行動(dòng)）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和總膳食纖維的測(cè)定”（最終批準(zhǔn)10-16-91）。
定義：
本方法是對(duì)AACC總膳食纖維（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纖維法（燕麥制品）32-21.01（見(jiàn)第9頁(yè)注1）的簡(jiǎn)化修改
1. 簡(jiǎn)單地說(shuō)，1g干燥食品樣品（復(fù)制品）通過(guò)熱穩(wěn)定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶進(jìn)行連續(xù)酶消化。
2. 過(guò)濾不溶性膳食纖維（IDF），然后用溫蒸餾水洗滌殘留物。用4體積95%乙醇（EtOH）沉淀濾液和水洗液的混合液，測(cè)定可溶性膳食纖維（SDF）。然后過(guò)濾沉淀物并干燥。SDF和IDF殘基均針對(duì)蛋白質(zhì)、灰分和空白進(jìn)行校正，以便最終計(jì)算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后過(guò)濾、干燥和稱重殘留物�？偵攀忱w維（TDF）值根據(jù)蛋白質(zhì)和灰分含量進(jìn)行校正。
經(jīng)美國(guó)谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)許可再版，美國(guó)明尼蘇達(dá)州圣保羅市。
范圍：
本方法測(cè)定加工食品和原材料（如谷類產(chǎn)品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和總膳食纖維含量。
儀器：
1. 400 mL和600 mL高的燒杯。
2. 熔塊坩堝，Gooch，熔塊盤(pán)，Pyrex50 mL，孔徑粗，ASTM 40-60µm，康寧諾。32940-50C或同等產(chǎn)品。準(zhǔn)備如下：®®
a、 在525°C下在馬弗爐中過(guò)夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰燼材料。
c、 室溫下，在2%微量清潔溶液（試劑7，第5頁(yè)）中浸泡1h。
d、 用水和去離子水沖洗坩堝。
e、 對(duì)于最終沖洗，使用15 mL丙酮并風(fēng)干。
f、 向干燥坩堝中添加約1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷卻坩堝約1小時(shí)，并記錄含有硅藻土的坩堝的重量。
3. 過(guò)濾瓶，厚壁，帶1L側(cè)臂。
4. 過(guò)濾瓶用橡膠環(huán)適配器。
5. 真空源：真空泵或抽氣器，帶有可調(diào)節(jié)真空的調(diào)節(jié)器。
6. 大容量（20-24升）帶蓋水浴槽；能夠保持100°C的溫度；配有自動(dòng)定時(shí)器，用于開(kāi)關(guān)操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 兩個(gè)機(jī)械對(duì)流烘箱，設(shè)置為103±2°C和130±3°C。
9. 定時(shí)器。
10. 帶SiO或同等干燥劑的密閉干燥器。干燥劑每?jī)芍茉?30°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH計(jì)。
12. 容量為50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 對(duì)于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 緩沖液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力攪拌器和攪拌棒。
16. 橡膠抹刀。
17. 馬弗爐，525±5°C。
試劑：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。將821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去離子水稀釋至一定體積。混合均勻。檢查液位，如有必要，添加更多去離子水，使其恢復(fù)至1L標(biāo)記。
3. 丙酮，試劑級(jí)。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。儲(chǔ)存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，熱穩(wěn)定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha單位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350個(gè)酪氨酸單位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麥芽糖苷單位/mL（或可溶性淀粉3300單位/mL）。
5. 去離子水。
6. Celite，分析級(jí)（Megazyme cat。編號(hào)G-CELI）。®TE公司
7. 清潔溶液，Micro（國(guó)際產(chǎn)品公司，新澤西州特倫頓）。用去離子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS緩沖液，每個(gè)0.05 M，24°C時(shí)pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-嗎啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。編號(hào)B-MES250）和12.2 g三羥甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去離子水。用6.0 N NaOH將pH調(diào)至8.2。用水稀釋至2升。重要的是將緩沖液的pH值在20°C時(shí)調(diào)整到約8.3，或在27-28°C時(shí)調(diào)節(jié)到大約8.1。
9. 鹽酸溶液，0.561 N。將93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中約700 mL水中。用水稀釋至1升。
10. pH標(biāo)準(zhǔn)。pH值為4.0、7.0和10.0的緩沖溶液。
酶純度：
為了確保有適當(dāng)?shù)拿富钚院蜎](méi)有不良的酶活性，在整個(gè)程序中運(yùn)行下列材料。每一批新的酶都要檢測(cè)，之前6個(gè)月沒(méi)有檢測(cè)過(guò)的酶也要檢測(cè)。
或者，酶活性和純度可以通過(guò)本手冊(cè)第17頁(yè)和第18頁(yè)總結(jié)的分析程序來(lái)確定。
一 該活動(dòng)不應(yīng)出現(xiàn)在測(cè)試中。該活動(dòng)應(yīng)在測(cè)試中完全發(fā)揮作用。由于柑橘果膠的不完全沉淀，其值較低。bc
d這種材料含有高水平的“抗酶”淀粉。準(zhǔn)確的預(yù)期回收值將受到試驗(yàn)中使用的耐熱α-淀粉酶水平的影響。
程序：
1空白
每次分析時(shí)，將兩個(gè)空白與樣品一起放在一起，以測(cè)量試劑對(duì)殘留物的貢獻(xiàn)。
2樣品
a、 準(zhǔn)確稱取復(fù)制的1.000±0.005 g樣品于400 mL高型燒杯中。
b、 向每個(gè)燒杯中添加40毫升MES-TRIS混合緩沖溶液（pH值8.2）。在每個(gè)燒杯中加入磁力攪拌棒。在磁力攪拌器上攪拌，直到樣品完全分散在溶液中（這可以防止塊狀物的形成，這會(huì)使樣品無(wú)法被酶吸收）。
三。熱穩(wěn)定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液，同時(shí)低速攪拌。
b、 在每個(gè)燒杯上蓋上鋁箔方塊。
c、 將蓋好的樣品置于98-100°c的振蕩水浴中，持續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。一旦所有燒杯都在熱水浴中，開(kāi)始計(jì)時(shí)。
4很酷
a、 從熱水浴中取出所有樣品燒杯并冷卻至60°C。
b、 拆下箔蓋。
c、 如有必要，用抹刀刮掉燒杯周?chē)娜魏苇h(huán)和燒杯底部的凝膠。
d、 用移液管用10毫升蒸餾水沖洗燒杯和抹刀的側(cè)壁。
e、 將熱水從浴槽中排出60°C的熱水。
5蛋白酶孵育
a、 向每個(gè)樣品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新蓋上鋁箔。
c、 在60±1°c的振蕩水浴中孵育，持續(xù)攪拌30分鐘，水浴溫度達(dá)到60°c時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。
6pH值檢查
a、 從振蕩水浴中取出樣品燒杯。
b、 拆下蓋子。
c、 攪拌時(shí)，向樣品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 檢查pH值，應(yīng)為4.1-4.8。如有必要，可使用額外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液調(diào)整pH值（見(jiàn)第10頁(yè)注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力攪拌器上攪拌的同時(shí)加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更換鋁蓋。
c、 在60°c的振蕩水浴中培養(yǎng)30分鐘，并持續(xù)攪拌。水浴溫度達(dá)到60°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。
A、 不溶性膳食纖維
8過(guò)濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 使用大約3毫升蒸餾水在坩堝中潤(rùn)濕和重新分配硅藻土層。
c、 對(duì)坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
9過(guò)濾酶混合物從步驟7通過(guò)坩堝進(jìn)入過(guò)濾瓶。
10洗滌殘?jiān)?/strong>用預(yù)熱到70°C的10毫升蒸餾水兩次。在清洗坩堝中的殘留物之前，用水沖洗燒杯。保存濾液和水洗液以測(cè)定SDF。將溶液轉(zhuǎn)移到預(yù)先去皮的600 mL高型燒杯中（對(duì)于SDF測(cè)定，請(qǐng)參閱第8頁(yè)SDF程序的第11步）。
11洗滌殘?jiān)?/strong>用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩堝在103°C烘箱中過(guò)夜。
13冷坩堝在干燥器中放置約1小時(shí)。稱量含有膳食纖維殘留物和硅藻土的坩堝，精確到最近
0.1毫克。減去皮重，即。
干燥坩堝和硅藻土的重量。
14蛋白質(zhì)和灰分測(cè)定。
對(duì)每種纖維的一個(gè)殘留物進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，并對(duì)第二個(gè)殘留物進(jìn)行灰分分析。
a、 用凱氏定氮法對(duì)殘留物進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。所有情況下使用6.25因子計(jì)算蛋白質(zhì)g。
b、 對(duì)于灰分分析，在525°C下將第二個(gè)殘?jiān)贌?小時(shí)。在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量，以確定灰分含量（見(jiàn)第10頁(yè)注3）。
B、 可溶性膳食纖維
1-10頁(yè)。遵循IDF方法的步驟1-10。1-10頁(yè)。遵循IDF方法的步驟1-10。
11稱IDF程序步驟10中預(yù)去皮燒杯中濾液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份預(yù)熱至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH從IDF程序中沖洗過(guò)濾瓶（步驟10）�；蛘�，將濾液和水洗液的混合溶液的重量調(diào)整至80 g，并添加320 mL預(yù)熱（60°C）95%EtOH。
b、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
13過(guò)濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 在坩堝中用15毫升78%乙醇從洗滌瓶中潤(rùn)濕并重新分配硅藻土層。
c、 對(duì)坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
14過(guò)濾
a、 通過(guò)坩堝過(guò)濾SDF步驟12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗滌瓶和橡膠抹刀，將所有剩余顆粒定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
15洗
使用真空，依次用以下兩份15毫升的溶液清洗殘留物：（見(jiàn)第10頁(yè)注4）。
a、 78%環(huán)氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩堝在103°C烘箱中過(guò)夜。
17繼續(xù)IDF方法的步驟13和14。
C、 總膳食纖維
1-7頁(yè)。遵循步驟1-7。1-7頁(yè)。遵循步驟1-7。
8用EtOH沉淀膳食纖維。
a、 向每個(gè)樣品中加入225毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C。加熱后測(cè)量體積。乙醇體積與樣品體積之比應(yīng)為4:1。如果95%的EtOH意外過(guò)熱至65°C，則添加228 mL用于擴(kuò)大酒精體積調(diào)節(jié)。
b、 用大鋁箔覆蓋所有樣品。
c、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
9繼續(xù)執(zhí)行SDF程序的步驟13-17。
計(jì)算：
膳食纖維(%) =
來(lái)自：R=m中的殘留物重量1；R=m中的殘留物重量2 m=樣品重量1；m=樣品重量21122 12
A=來(lái)自R的灰分重量；p=來(lái)自R和12
來(lái)自：
BR=空白殘留物；BP=來(lái)自BR BA的空白蛋白質(zhì)=BR的空白灰分。12
提示：這些計(jì)算可以通過(guò)使用Megazyme Mega Calc來(lái)簡(jiǎn)化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站).TM公司
注意：
1. 本方法與AACC方法32-05.01和32-21.01的區(qū)別如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS緩沖液，每個(gè)0.05 M，24°C時(shí)pH值8.2，而不是50 mL磷酸鹽緩沖液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS緩沖液的pH值隨溫度變化。
MES-TRIS緩沖液（即24°C時(shí)為8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，熱穩(wěn)定α-淀粉酶的最適pH值從60°C時(shí)的pH 6.0移動(dòng)到90°C時(shí)的pH 7.0。
b、 由于此處使用的酶活性更高，使用的耐熱α-淀粉酶的體積已從200µL減少到50µL。
c、 如有必要，刮掉燒杯周?chē)跓岱�(wěn)定α-淀粉酶培養(yǎng)后留下的任何環(huán)。在熱穩(wěn)定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水沖洗抹刀和燒杯側(cè)壁。
d、 蛋白酶作用不需要調(diào)節(jié)pH值，因此培養(yǎng)液中不添加NaOH。
e、 對(duì)于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 對(duì)于TDF測(cè)定，沉淀步驟中添加的95%EtOH的量為225 mL，而不是280 mL。對(duì)于SDF/IDF測(cè)定，濾液和洗滌液的重量調(diào)整為80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH�；蛘�，稱取濾液和洗滌液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通過(guò)此修改，總過(guò)濾體積減少到375-400 mL（參見(jiàn)第11頁(yè)和第12頁(yè)圖1和2）。
2. 由于溶液的pH值在較低溫度下會(huì)增加，因此在60°C水浴中放置燒杯直到其準(zhǔn)備好進(jìn)行pH值調(diào)整。一般情況下，大多數(shù)燕麥、大麥、小麥和玉米制品不需要額外的pH調(diào)節(jié)（用5%的HCl或5%的NaOH）。對(duì)于此類已知產(chǎn)品，在向樣品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳過(guò)pH檢查程序。建議將空白溶液pH值的常規(guī)檢查作為災(zāi)難性檢查。如果空白不在理想的pH值范圍內(nèi)，也應(yīng)檢查樣品。
3. 有一些跡象表明，延遲用95%的EtOH和丙酮清洗IDF殘留物可能會(huì)導(dǎo)致IDF值膨脹。因此，建議在SDF/IDF程序結(jié)束時(shí)不要沖洗IDF殘留物。
4. 在一些樣品中，會(huì)形成樹(shù)膠，從而捕獲液體。如果出現(xiàn)這種情況，用抹刀將薄膜層弄碎。
參考文獻(xiàn)：
1. Lee，S.C.，Prosky，L.和DeVries，J.W.（1992年）。食品中總可溶性和不溶性膳食纖維的測(cè)定.酶重量法，MES-TRIS緩沖液：協(xié)作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)�！痘瘜W(xué)》，75395-416。
2. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達(dá)，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室間研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)�！痘瘜W(xué)》，711017-1023。
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化學(xué)。, 75, 360-367.
圖1。總膳食纖維測(cè)定程序的分析方案。
圖2.可溶性和不溶性膳食纖維測(cè)定程序的分析方案。
方法2：
總膳食纖維的測(cè)定
根據(jù)AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
儀器：
1. 分配器
a、 對(duì)于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮為10±0.5 mL。
c、 緩沖液為50±0.5 mL。
2. 所有其他設(shè)備如本手冊(cè)第4頁(yè)所述。
試劑：
1. pH值為6.0.08的磷酸鹽緩沖液。將1.400 g無(wú)水磷酸二鈉（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二鈉（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在約700 mL蒸餾水中。用水稀釋至1升。用pH計(jì)檢查pH值。2424
2. 氫氧化鈉溶液，0.275 N。使用適當(dāng)?shù)奶幚眍A(yù)防措施，將11.00 g ACS級(jí)NaOH溶解在約700 mL蒸餾水中，并放入1 L容量瓶中。冷卻并用水稀釋至一定體積。
3. 0.325N鹽酸溶液。在容量瓶中用水將已知滴定度的儲(chǔ)備溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀釋至1 L。
程序：
樣品制備
總膳食纖維應(yīng)以干燥、低脂或無(wú)脂樣品為基礎(chǔ)進(jìn)行測(cè)定。使樣品均勻化，并在70°C真空烘箱中干燥過(guò)夜。在干燥器中冷卻，重新稱重并記錄干燥過(guò)程中的重量損失。將干燥樣品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的篩網(wǎng)。如果樣品不能加熱，則在研磨前冷凍干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨礙正確研磨，則在研磨前用石油醚脫脂三次，每次25毫升（每克樣品）。分析混合膳食時(shí)，在測(cè)定總膳食纖維之前，一定要先提取脂肪。記錄因脂肪導(dǎo)致的體重減輕。正確測(cè)定去除水分和脂肪的最終膳食纖維百分比。將干燥研磨后的樣品儲(chǔ)存在干燥器中的加蓋罐中，直到分析開(kāi)始。
方法
在整個(gè)過(guò)程中使用空白樣品，以測(cè)量從試劑到殘留物的任何貢獻(xiàn)。
1. 稱取兩份1g樣品，精確至0.1mg，放入400ml高型燒杯中。樣品重量的差異應(yīng)小于
彼此各20毫克。向每個(gè)燒杯中添加50毫升磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），并用pH計(jì)檢查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，則進(jìn)行調(diào)整。
2. 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液。
3. 在燒杯上蓋上鋁箔，放入沸水浴中。燒杯必須在98-100°C下培養(yǎng)15分鐘。每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)。
注：當(dāng)槽中燒杯的數(shù)量使燒杯內(nèi)容物難以達(dá)到98-100°C的內(nèi)部溫度時(shí)，應(yīng)增加培養(yǎng)時(shí)間。使用溫度計(jì)指示
在98-100°C下達(dá)到15分鐘。在沸水浴中總共30分鐘應(yīng)足夠。
4. 室溫下冷卻溶液。
5. 通過(guò)添加10 mL 0.275 N NaOH溶液將pH值調(diào)整至7.5±0.1。用pH計(jì)檢查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用鋁箔蓋住燒杯，在60°C下培養(yǎng)，連續(xù)攪拌30分鐘。
8. 冷卻并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以調(diào)節(jié)pH至
4.5±0.2。用pH計(jì)檢查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，蓋上鋁箔，在60°C下連續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。
10. 添加280毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C（加熱前測(cè)量體積）。讓沉淀在室溫下形成
60分鐘。
11. 稱取含有硅藻土的坩堝，精確至0.1 mg，然后使用洗滌瓶中78%的EtOH氣流濕潤(rùn)并分配坩堝中的硅藻土層。
12. 用吸力將硅藻土拉到燒結(jié)玻璃上，使其成為均勻的墊子。保持吸力，并將沉淀從酶消化液中定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，兩份10毫升95%乙醇和兩份
10毫升丙酮。在某些情況下，可能會(huì)形成牙齦
過(guò)濾過(guò)程中，將液體截留在殘?jiān)�。如果是這樣，用抹刀打破表面薄膜，以提高過(guò)濾效果。在整個(gè)過(guò)濾過(guò)程中，小心的間歇抽吸可以避免較長(zhǎng)的過(guò)濾時(shí)間。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空氣烘箱中干燥含有殘留物的坩堝過(guò)夜。
15. 在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的重量，以確定殘留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25為轉(zhuǎn)換因子，分析一組重復(fù)樣品中的蛋白質(zhì)殘留。
17. 在525°C下將第二份殘留物樣品焚燒5 h。在干燥器中冷卻并稱重至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量以測(cè)定灰分。
圖3。總膳食纖維分析方案。
計(jì)算：
如果在樣品制備步驟中對(duì)樣品進(jìn)行脫脂或干燥，則對(duì)脂肪和/或水的最終%TDF進(jìn)行校正。
提示：這些計(jì)算可以通過(guò)使用Megazyme Mega Calc來(lái)簡(jiǎn)化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站). 另請(qǐng)參閱本手冊(cè)第9頁(yè)。TM公司
參考文獻(xiàn)：
1. 官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)。（1985年）。官方分析方法，第14版，補(bǔ)遺1期。秒。43，A14-43，A20，第399頁(yè)。
2. 官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（1986年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)。《化學(xué)》，69370。
3. 官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（1987年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)�；瘜W(xué)，70，393。
4. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，弗爾達(dá)，I.，德弗里斯，J.W.，施維澤，T.F.和哈蘭，B.F.（1985年）。食品和食品中總膳食纖維的測(cè)定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)。化學(xué)，68677。
5. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達(dá)，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測(cè)定。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)�！痘瘜W(xué)》，711017。
活性和純度的測(cè)量
用于總膳食纖維測(cè)量的酶
為了成功應(yīng)用AACC/AOAC國(guó)際膳食纖維分析程序，所用的酶必須具有所需的活性，并且沒(méi)有重要的污染活性。迄今為止遇到的一些問(wèn)題包括：
a、 纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶污染淀粉葡萄糖苷酶（導(dǎo)致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果膠降解和低估）。
b、 不同濃度的耐熱α-淀粉酶（影響抗性淀粉的測(cè)量）（見(jiàn)參考文獻(xiàn)1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（導(dǎo)致對(duì)β-葡聚糖的低估）。
所需活動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)化：
根據(jù)AACC/AOAC國(guó)際膳食纖維測(cè)定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用歷史，準(zhǔn)確可靠測(cè)量所需的活性為：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次檢測(cè)0.2毫升。
3300單位/毫升（用還原糖測(cè)定可溶性淀粉）或
200單位/毫升（AMG分析試劑；過(guò)量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麥芽糖苷）。
耐熱α-淀粉酶（地衣芽孢桿菌）；每次測(cè)定0.05毫升。
10000 U/mL（用還原糖測(cè)定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha試劑；在耐熱α-葡萄糖苷酶存在下阻斷對(duì)硝基苯基麥芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢桿菌；枯草桿菌素A）；每次檢測(cè)0.10毫升。350酪氨酸單位/mL。（50毫克/毫升；7個(gè)酪氨酸單位/毫克）（用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）進(jìn)行檢測(cè)。編號(hào)S-AZCAS）。
更多詳情：
McCleary，B.V.（1999年）。纖維酶純度和活性測(cè)定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活動(dòng)：
1在淀粉葡萄糖苷酶制劑中：
對(duì)用于膳食纖維測(cè)定的淀粉葡萄糖苷酶制劑的評(píng)價(jià)表明，許多制劑（除了純度很高、價(jià)格昂貴的制劑外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纖維素酶）。在某些制劑中，這種污染高達(dá)1%（以活性計(jì)），并導(dǎo)致β-葡聚糖的低估高達(dá)10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纖維素酶污染可以通過(guò)以大麥β-葡聚糖為底物的粘度學(xué)研究或通過(guò)使用Megazymeβ-葡聚糖酶測(cè)試片（用于β-葡聚糖酶和纖維素酶的測(cè)量）來(lái)最好地證明和估計(jì)。
淀粉葡萄糖苷酶的纖維素酶污染對(duì)β-葡聚糖粘度（即分子大�。┑挠绊懭鐖D4所示。將大麥β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸鈉緩沖液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度計(jì)中與淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制劑）一起培養(yǎng)。在不同的時(shí)間間隔進(jìn)行粘度測(cè)量，比粘度計(jì)算為（t-t）/t，其中t是溶劑的流動(dòng)時(shí)間，t是消化液的流動(dòng)時(shí)間。ooo
比較了兩種酶制劑：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（與用于TDF測(cè)定的其他商業(yè)制劑的AMG濃度相同）。
B。另一種市售淀粉葡萄糖苷酶制劑，推薦用于膳食纖維測(cè)定。
很明顯，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上沒(méi)有污染β-葡聚糖酶，而另一種制劑含有大量的這種污染物。
2在蛋白酶制劑中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纖維素酶的測(cè)量程序進(jìn)行測(cè)定，修改后測(cè)定pH值為7.5（磷酸鈉緩沖液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制劑中：
耐熱α-淀粉酶無(wú)污染酶活性。
圖4。以大麥β-葡聚糖為底物的粘度計(jì)測(cè)定淀粉葡萄糖苷酶制劑中的纖維素酶污染（參考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一種用于膳食纖維測(cè)定的淀粉葡萄糖苷酶制劑。
膳食纖維是一種復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)的混合物，包括親水性化合物，如可溶和不可溶的多糖和不可消化的低聚糖，以及一系列不健康的或多或少疏水性的化合物，如角質(zhì)、樹(shù)莓和木脂素。本手冊(cè)中概述的總膳食纖維測(cè)定程序基于Lee等人的方法。以及Prosky等人。（AOAC 991.43、AOAC 985.29、AACC 32-07.01和AACC 32-05.01）。然而，Megazyme全膳食纖維試劑盒中的酶也可用于其他膳食纖維分析方法，如AACC方法32-21.01和AACC方法32-06.01。12,3
原理（總膳食纖維）：
總膳食纖維（TDF）是在干燥和脫脂（如果脂肪含量大于10%）材料的復(fù)樣上測(cè)定的。樣品在~100°C下用熱穩(wěn)定α-淀粉酶煮熟，使淀粉凝膠化、水解和解聚；在60°C下與蛋白酶（溶解和解聚蛋白質(zhì)）和淀粉葡萄糖苷酶（將淀粉碎片水解成葡萄糖）一起培養(yǎng)；用四體積乙醇沉淀可溶性纖維，去除淀粉中解聚的蛋白質(zhì)和葡萄糖。過(guò)濾殘留物；用78%乙醇、95%乙醇和丙酮洗滌；干燥；稱重。對(duì)一份樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，另一份在525°C下培養(yǎng)以測(cè)定灰分。TDF是過(guò)濾和干燥殘?jiān)闹亓繙p去蛋白質(zhì)和灰分的重量。
Megazyme-TDF檢測(cè)試劑盒的主要優(yōu)點(diǎn)是它含有高純度、無(wú)干擾活性的酶，并且酶的活性是標(biāo)準(zhǔn)化的。標(biāo)準(zhǔn)化α-淀粉酶活性在抗性淀粉測(cè)定中的重要性已得到公認(rèn)。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶基本上不含纖維素酶，而其他常用制劑含有嚴(yán)重的這種活性污染，導(dǎo)致β-葡聚糖的溶解和低估。所有的Megazyme TDF酶都以即用、穩(wěn)定的液態(tài)形式供應(yīng)。
范圍：
適用于谷類、果蔬、谷類水果制品及食品。
酶純度和標(biāo)準(zhǔn)化：
采用AOAC方法985.29和991.43和AACC方法32-05.01中推薦的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估了巨酶α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶的有效性和純度。Megazyme耐熱α-淀粉酶（E-BLAAM）的活性為3000 U/mL（Ceralpha法）；蛋白酶的供應(yīng)濃度為50 mg/mL（~350酪氨酸U/mL）；淀粉葡萄糖苷酶的供應(yīng)濃度為200 U/mL（對(duì)硝基苯基β-麥芽糖苷甙底物）（或可溶性淀粉3300 U/mL）。這種淀粉葡萄糖苷酶活性是傳統(tǒng)TDF分析中所用濃度的150%，因此在分析中使用0.2毫升（而不是0.3毫升）。
Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上不含纖維素酶，而在用于TDF測(cè)定的其他制劑中，纖維素酶污染可高達(dá)淀粉葡萄糖苷酶的1%（以活性計(jì)）。這種程度的污染導(dǎo)致β-葡聚糖的低估率高達(dá)10-15%。
巨酵素酶的測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)化方法可根據(jù)要求提供。
TDF檢測(cè)試劑盒：
Megazyme提供100/200分析試劑盒，其中包含完整的分析方法以及：
100測(cè)定試劑盒（cat。不。K-TDFR-100A）
| 瓶子1： | 耐熱α-淀粉酶（10毫升，~3000 U/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。編號(hào)：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 純化蛋白酶（10毫升，50毫克/毫升；約350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。編號(hào)E-BSPRT）。 | |
| 瓶子3： | 純化淀粉葡萄糖苷酶（20ml，3300u/mL |
| 可溶性淀粉）（Megazyme cat。編號(hào)：E-AMGDF）。 |
| 瓶子1： | 耐熱α-淀粉酶（20ml，~3000u/mL |
| （Ceralpha法）；~10000 U/mL（可溶性） | |
| 淀粉）（Megazyme cat。編號(hào)：E-BLAAM）。 | |
| 瓶子2： | 純化蛋白酶（20毫升，50毫克/毫升；約350酪氨酸 |
| U/mL）（Megazyme cat。編號(hào)E-BSPRT）。 |
瓶子3：（x 2）純化淀粉葡萄糖苷酶（20毫升，可溶性淀粉3300 U/mL）（Megazyme cat。編號(hào)：E-AMGDF）。
分析級(jí)硅藻土，100 g或500 g包裝，可單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)（類別。編號(hào)G-CEL-100G或cat。編號(hào)G-CEL-500G）。®
TDF檢測(cè)對(duì)照試劑盒（）：K-TDFC公司
該試劑盒與TDF分析試劑盒一起使用，以確定酶的有效性和純度。該試劑盒包含下列每種成分的一小瓶和一份技術(shù)數(shù)據(jù)表（K-TDFC；膳食纖維對(duì)照品）。
該試劑盒中包含的每種成分的量足以進(jìn)行至少10次分析。
| 組件 | 數(shù)量 |
| β-葡聚糖（大麥） | 1克 |
| 高直鏈淀粉 | 10克 |
| 淀粉（小麥） | 10克 |
| 酪蛋白 | 5克 |
| 果膠 | 1克 |
| 落葉松半乳糖 | 1克 |
方法1：
總、可溶性和不溶性膳食纖維的測(cè)定
根據(jù)AOAC方法991.43“總、可溶和不溶
《食品中的膳食纖維》（1991年第一次行動(dòng)）和AACC法
32-07.01“食品和食品中可溶性、不溶性和總膳食纖維的測(cè)定”（最終批準(zhǔn)10-16-91）。
定義：
本方法是對(duì)AACC總膳食纖維（TDF）法（32-05.01）和AACC可溶性/不溶性膳食纖維法（燕麥制品）32-21.01（見(jiàn)第9頁(yè)注1）的簡(jiǎn)化修改
1. 簡(jiǎn)單地說(shuō)，1g干燥食品樣品（復(fù)制品）通過(guò)熱穩(wěn)定α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶進(jìn)行連續(xù)酶消化。
2. 過(guò)濾不溶性膳食纖維（IDF），然后用溫蒸餾水洗滌殘留物。用4體積95%乙醇（EtOH）沉淀濾液和水洗液的混合液，測(cè)定可溶性膳食纖維（SDF）。然后過(guò)濾沉淀物并干燥。SDF和IDF殘基均針對(duì)蛋白質(zhì)、灰分和空白進(jìn)行校正，以便最終計(jì)算SDF和IDF值。
3. 用EtOH沉淀SDF，然后過(guò)濾、干燥和稱重殘留物�？偵攀忱w維（TDF）值根據(jù)蛋白質(zhì)和灰分含量進(jìn)行校正。
經(jīng)美國(guó)谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)許可再版，美國(guó)明尼蘇達(dá)州圣保羅市。
范圍：
本方法測(cè)定加工食品和原材料（如谷類產(chǎn)品、水果和蔬菜）中的可溶性、不溶性和總膳食纖維含量。
儀器：
1. 400 mL和600 mL高的燒杯。
2. 熔塊坩堝，Gooch，熔塊盤(pán)，Pyrex50 mL，孔徑粗，ASTM 40-60µm，康寧諾。32940-50C或同等產(chǎn)品。準(zhǔn)備如下：®®
a、 在525°C下在馬弗爐中過(guò)夜。
b、 用真空除去硅藻土和灰燼材料。
c、 室溫下，在2%微量清潔溶液（試劑7，第5頁(yè)）中浸泡1h。
d、 用水和去離子水沖洗坩堝。
e、 對(duì)于最終沖洗，使用15 mL丙酮并風(fēng)干。
f、 向干燥坩堝中添加約1.0 g硅藻土，并在130°C下干燥至恒重。
g、 在干燥器中冷卻坩堝約1小時(shí)，并記錄含有硅藻土的坩堝的重量。
3. 過(guò)濾瓶，厚壁，帶1L側(cè)臂。
4. 過(guò)濾瓶用橡膠環(huán)適配器。
5. 真空源：真空泵或抽氣器，帶有可調(diào)節(jié)真空的調(diào)節(jié)器。
6. 大容量（20-24升）帶蓋水浴槽；能夠保持100°C的溫度；配有自動(dòng)定時(shí)器，用于開(kāi)關(guān)操作。
7. 天平，0.1mg精度。
8. 兩個(gè)機(jī)械對(duì)流烘箱，設(shè)置為103±2°C和130±3°C。
9. 定時(shí)器。
10. 帶SiO或同等干燥劑的密閉干燥器。干燥劑每?jī)芍茉?30°C烘箱中干燥一夜。2
11. pH計(jì)。
12. 容量為50μL和5μL的移液管。
13. 分配器
a、 對(duì)于78%EtOH、95%EtOH和丙酮，15±0.5 mL。
b、 緩沖液40±0.5 mL。
14. 量筒，500毫升。
15. 磁力攪拌器和攪拌棒。
16. 橡膠抹刀。
17. 馬弗爐，525±5°C。
試劑：
1. 乙醇，95%v/v。
2. 乙醇，78%。將821 mL 95%v/v乙醇放入1 L容量瓶中。用去離子水稀釋至一定體積。混合均勻。檢查液位，如有必要，添加更多去離子水，使其恢復(fù)至1L標(biāo)記。
3. 丙酮，試劑級(jí)。
4. TDF分析用酶（巨酵素）。儲(chǔ)存在0-5°C。
a、 α-淀粉酶，熱穩(wěn)定（E-BLAAM）；3000 Ceralpha單位/mL。
b、 蛋白酶（E-BSPRT）；50毫克/毫升；350個(gè)酪氨酸單位/毫升。
c、 淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）；200 pNPβ-麥芽糖苷單位/mL（或可溶性淀粉3300單位/mL）。
5. 去離子水。
6. Celite，分析級(jí)（Megazyme cat。編號(hào)G-CELI）。®TE公司
7. 清潔溶液，Micro（國(guó)際產(chǎn)品公司，新澤西州特倫頓）。用去離子水配制2%溶液。
8. MES/TRIS緩沖液，每個(gè)0.05 M，24°C時(shí)pH值8.2。溶解
19.52 g 2（N-嗎啉基）乙磺酸（MES）（Megazyme cat。編號(hào)B-MES250）和12.2 g三羥甲基氨基甲烷（tris）（Megazyme cat。1.7升去離子水。用6.0 N NaOH將pH調(diào)至8.2。用水稀釋至2升。重要的是將緩沖液的pH值在20°C時(shí)調(diào)整到約8.3，或在27-28°C時(shí)調(diào)節(jié)到大約8.1。
9. 鹽酸溶液，0.561 N。將93.5 mL 6 N HCl加入1 L容量瓶中約700 mL水中。用水稀釋至1升。
10. pH標(biāo)準(zhǔn)。pH值為4.0、7.0和10.0的緩沖溶液。
酶純度：
為了確保有適當(dāng)?shù)拿富钚院蜎](méi)有不良的酶活性，在整個(gè)程序中運(yùn)行下列材料。每一批新的酶都要檢測(cè)，之前6個(gè)月沒(méi)有檢測(cè)過(guò)的酶也要檢測(cè)。
或者，酶活性和純度可以通過(guò)本手冊(cè)第17頁(yè)和第18頁(yè)總結(jié)的分析程序來(lái)確定。
| |
活動(dòng) | 樣品重量 | 預(yù)期 |
| 試驗(yàn)樣品 | 測(cè)試 | （克） | 回收率（%） |
| 柑橘果膠 | 果膠酶一 | 0.1 | 90-95c |
| β-葡聚糖（大麥） |
β-葡聚糖酶 （纖維素酶）一 |
0.1 | 95-100 |
| 小麥淀粉 | 淀粉酶b | 1.0 | 0-1 |
| 酪蛋白 | 蛋白酶b | 0.3 | 0-2 |
| 高直鏈淀粉 | 淀粉酶 | 1.0 | ~30個(gè)d |
一 該活動(dòng)不應(yīng)出現(xiàn)在測(cè)試中。該活動(dòng)應(yīng)在測(cè)試中完全發(fā)揮作用。由于柑橘果膠的不完全沉淀，其值較低。bc
d這種材料含有高水平的“抗酶”淀粉。準(zhǔn)確的預(yù)期回收值將受到試驗(yàn)中使用的耐熱α-淀粉酶水平的影響。
程序：
1空白
每次分析時(shí)，將兩個(gè)空白與樣品一起放在一起，以測(cè)量試劑對(duì)殘留物的貢獻(xiàn)。
2樣品
a、 準(zhǔn)確稱取復(fù)制的1.000±0.005 g樣品于400 mL高型燒杯中。
b、 向每個(gè)燒杯中添加40毫升MES-TRIS混合緩沖溶液（pH值8.2）。在每個(gè)燒杯中加入磁力攪拌棒。在磁力攪拌器上攪拌，直到樣品完全分散在溶液中（這可以防止塊狀物的形成，這會(huì)使樣品無(wú)法被酶吸收）。
三。熱穩(wěn)定淀粉酶孵育α
a、 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液，同時(shí)低速攪拌。
b、 在每個(gè)燒杯上蓋上鋁箔方塊。
c、 將蓋好的樣品置于98-100°c的振蕩水浴中，持續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。一旦所有燒杯都在熱水浴中，開(kāi)始計(jì)時(shí)。
4很酷
a、 從熱水浴中取出所有樣品燒杯并冷卻至60°C。
b、 拆下箔蓋。
c、 如有必要，用抹刀刮掉燒杯周?chē)娜魏苇h(huán)和燒杯底部的凝膠。
d、 用移液管用10毫升蒸餾水沖洗燒杯和抹刀的側(cè)壁。
e、 將熱水從浴槽中排出60°C的熱水。
5蛋白酶孵育
a、 向每個(gè)樣品中添加100µL蛋白酶溶液。
b、 重新蓋上鋁箔。
c、 在60±1°c的振蕩水浴中孵育，持續(xù)攪拌30分鐘，水浴溫度達(dá)到60°c時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。
6pH值檢查
a、 從振蕩水浴中取出樣品燒杯。
b、 拆下蓋子。
c、 攪拌時(shí)，向樣品中加入5ml 0.561N HCl溶液。
d、 檢查pH值，應(yīng)為4.1-4.8。如有必要，可使用額外的5%NaOH溶液或5%HCl溶液調(diào)整pH值（見(jiàn)第10頁(yè)注2）。
7淀粉葡萄糖苷酶孵育
a、 在磁力攪拌器上攪拌的同時(shí)加入200微升的淀粉葡萄糖苷酶溶液。
b、 更換鋁蓋。
c、 在60°c的振蕩水浴中培養(yǎng)30分鐘，并持續(xù)攪拌。水浴溫度達(dá)到60°C時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。
A、 不溶性膳食纖維
8過(guò)濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 使用大約3毫升蒸餾水在坩堝中潤(rùn)濕和重新分配硅藻土層。
c、 對(duì)坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
9過(guò)濾酶混合物從步驟7通過(guò)坩堝進(jìn)入過(guò)濾瓶。
10洗滌殘?jiān)?/strong>用預(yù)熱到70°C的10毫升蒸餾水兩次。在清洗坩堝中的殘留物之前，用水沖洗燒杯。保存濾液和水洗液以測(cè)定SDF。將溶液轉(zhuǎn)移到預(yù)先去皮的600 mL高型燒杯中（對(duì)于SDF測(cè)定，請(qǐng)參閱第8頁(yè)SDF程序的第11步）。
11洗滌殘?jiān)?/strong>用10毫升：
a、 95%乙醚
b、 丙酮
12干坩堝在103°C烘箱中過(guò)夜。
13冷坩堝在干燥器中放置約1小時(shí)。稱量含有膳食纖維殘留物和硅藻土的坩堝，精確到最近
0.1毫克。減去皮重，即。
干燥坩堝和硅藻土的重量。
14蛋白質(zhì)和灰分測(cè)定。
對(duì)每種纖維的一個(gè)殘留物進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，并對(duì)第二個(gè)殘留物進(jìn)行灰分分析。
a、 用凱氏定氮法對(duì)殘留物進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。所有情況下使用6.25因子計(jì)算蛋白質(zhì)g。
b、 對(duì)于灰分分析，在525°C下將第二個(gè)殘?jiān)贌?小時(shí)。在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量，以確定灰分含量（見(jiàn)第10頁(yè)注3）。
B、 可溶性膳食纖維
1-10頁(yè)。遵循IDF方法的步驟1-10。1-10頁(yè)。遵循IDF方法的步驟1-10。
11稱IDF程序步驟10中預(yù)去皮燒杯中濾液和水洗液的混合溶液。
12SDF沉淀
a、 添加4份預(yù)熱至60°C的95%EtOH。使用一部分EtOH從IDF程序中沖洗過(guò)濾瓶（步驟10）�；蛘�，將濾液和水洗液的混合溶液的重量調(diào)整至80 g，并添加320 mL預(yù)熱（60°C）95%EtOH。
b、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
13過(guò)濾裝置
a、 將含有硅藻土的坩堝去皮，精確至0.1 mg。
b、 在坩堝中用15毫升78%乙醇從洗滌瓶中潤(rùn)濕并重新分配硅藻土層。
c、 對(duì)坩堝施加抽吸，將硅藻土拉到熔塊玻璃上，形成均勻的墊子。
14過(guò)濾
a、 通過(guò)坩堝過(guò)濾SDF步驟12中沉淀的酶消化物。
b、 使用含78%乙醚的洗滌瓶和橡膠抹刀，將所有剩余顆粒定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
15洗
使用真空，依次用以下兩份15毫升的溶液清洗殘留物：（見(jiàn)第10頁(yè)注4）。
a、 78%環(huán)氧乙烷
b、 95%乙醚
c、 丙酮
16干坩堝在103°C烘箱中過(guò)夜。
17繼續(xù)IDF方法的步驟13和14。
C、 總膳食纖維
1-7頁(yè)。遵循步驟1-7。1-7頁(yè)。遵循步驟1-7。
8用EtOH沉淀膳食纖維。
a、 向每個(gè)樣品中加入225毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C。加熱后測(cè)量體積。乙醇體積與樣品體積之比應(yīng)為4:1。如果95%的EtOH意外過(guò)熱至65°C，則添加228 mL用于擴(kuò)大酒精體積調(diào)節(jié)。
b、 用大鋁箔覆蓋所有樣品。
c、 讓沉淀在室溫下形成60分鐘。
9繼續(xù)執(zhí)行SDF程序的步驟13-17。
計(jì)算：
膳食纖維(%) =
來(lái)自：R=m中的殘留物重量1；R=m中的殘留物重量2 m=樣品重量1；m=樣品重量21122 12
A=來(lái)自R的灰分重量；p=來(lái)自R和12
來(lái)自：
BR=空白殘留物；BP=來(lái)自BR BA的空白蛋白質(zhì)=BR的空白灰分。12
提示：這些計(jì)算可以通過(guò)使用Megazyme Mega Calc來(lái)簡(jiǎn)化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站).TM公司
注意：
1. 本方法與AACC方法32-05.01和32-21.01的區(qū)別如下：
a、 使用40 mL MES-TRIS緩沖液，每個(gè)0.05 M，24°C時(shí)pH值8.2，而不是50 mL磷酸鹽緩沖液，0.08 M，pH 6.0。
MES-TRIS緩沖液的pH值隨溫度變化。
MES-TRIS緩沖液（即24°C時(shí)為8.2）的pH值在
85-90°C和7.4-7.6（55-60°C）。注意，熱穩(wěn)定α-淀粉酶的最適pH值從60°C時(shí)的pH 6.0移動(dòng)到90°C時(shí)的pH 7.0。
b、 由于此處使用的酶活性更高，使用的耐熱α-淀粉酶的體積已從200µL減少到50µL。
c、 如有必要，刮掉燒杯周?chē)跓岱�(wěn)定α-淀粉酶培養(yǎng)后留下的任何環(huán)。在熱穩(wěn)定α-淀粉酶孵育后，用移液管加入10ml水沖洗抹刀和燒杯側(cè)壁。
d、 蛋白酶作用不需要調(diào)節(jié)pH值，因此培養(yǎng)液中不添加NaOH。
e、 對(duì)于淀粉葡萄糖苷酶的作用，添加5 mL 0.561 N HCl溶液。
f、 對(duì)于TDF測(cè)定，沉淀步驟中添加的95%EtOH的量為225 mL，而不是280 mL。對(duì)于SDF/IDF測(cè)定，濾液和洗滌液的重量調(diào)整為80 g，而不是100 g。因此，在60℃下添加320 mL 95%EtOH�；蛘�，稱取濾液和洗滌液的混合液并加入4 vol。95%乙醇。通過(guò)此修改，總過(guò)濾體積減少到375-400 mL（參見(jiàn)第11頁(yè)和第12頁(yè)圖1和2）。
2. 由于溶液的pH值在較低溫度下會(huì)增加，因此在60°C水浴中放置燒杯直到其準(zhǔn)備好進(jìn)行pH值調(diào)整。一般情況下，大多數(shù)燕麥、大麥、小麥和玉米制品不需要額外的pH調(diào)節(jié)（用5%的HCl或5%的NaOH）。對(duì)于此類已知產(chǎn)品，在向樣品中添加5 mL 0.561 N HCl后，可以跳過(guò)pH檢查程序。建議將空白溶液pH值的常規(guī)檢查作為災(zāi)難性檢查。如果空白不在理想的pH值范圍內(nèi)，也應(yīng)檢查樣品。
3. 有一些跡象表明，延遲用95%的EtOH和丙酮清洗IDF殘留物可能會(huì)導(dǎo)致IDF值膨脹。因此，建議在SDF/IDF程序結(jié)束時(shí)不要沖洗IDF殘留物。
4. 在一些樣品中，會(huì)形成樹(shù)膠，從而捕獲液體。如果出現(xiàn)這種情況，用抹刀將薄膜層弄碎。
參考文獻(xiàn)：
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2. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達(dá)，I.（1988年）。食品和食品中不溶性、可溶性和總膳食纖維的測(cè)定：實(shí)驗(yàn)室間研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)�！痘瘜W(xué)》，711017-1023。
3. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，施維澤，T.F.，德弗里斯，J.W.和弗爾達(dá)，I.（1992年）。食品和食品中不溶性和可溶性膳食纖維的測(cè)定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)。
化學(xué)。, 75, 360-367.
圖1。總膳食纖維測(cè)定程序的分析方案。
圖2.可溶性和不溶性膳食纖維測(cè)定程序的分析方案。
方法2：
總膳食纖維的測(cè)定
根據(jù)AACC方法32-05.01和AOAC方法985.29。
儀器：
1. 分配器
a、 對(duì)于95%乙醇，280±2.0 mL。
b、 78%乙醇、95%乙醇和丙酮為10±0.5 mL。
c、 緩沖液為50±0.5 mL。
2. 所有其他設(shè)備如本手冊(cè)第4頁(yè)所述。
試劑：
1. pH值為6.0.08的磷酸鹽緩沖液。將1.400 g無(wú)水磷酸二鈉（或1.753 g二水合物）和9.68 g一水磷酸二鈉（NaHPO）（或10.94 g二水合物）溶解在約700 mL蒸餾水中。用水稀釋至1升。用pH計(jì)檢查pH值。2424
2. 氫氧化鈉溶液，0.275 N。使用適當(dāng)?shù)奶幚眍A(yù)防措施，將11.00 g ACS級(jí)NaOH溶解在約700 mL蒸餾水中，并放入1 L容量瓶中。冷卻并用水稀釋至一定體積。
3. 0.325N鹽酸溶液。在容量瓶中用水將已知滴定度的儲(chǔ)備溶液（即325 mL 1.0 N HCl）稀釋至1 L。
程序：
樣品制備
總膳食纖維應(yīng)以干燥、低脂或無(wú)脂樣品為基礎(chǔ)進(jìn)行測(cè)定。使樣品均勻化，并在70°C真空烘箱中干燥過(guò)夜。在干燥器中冷卻，重新稱重并記錄干燥過(guò)程中的重量損失。將干燥樣品的一部分干燥至0.3-0.5 mm的篩網(wǎng)。如果樣品不能加熱，則在研磨前冷凍干燥。如果高脂肪含量（>10%）妨礙正確研磨，則在研磨前用石油醚脫脂三次，每次25毫升（每克樣品）。分析混合膳食時(shí)，在測(cè)定總膳食纖維之前，一定要先提取脂肪。記錄因脂肪導(dǎo)致的體重減輕。正確測(cè)定去除水分和脂肪的最終膳食纖維百分比。將干燥研磨后的樣品儲(chǔ)存在干燥器中的加蓋罐中，直到分析開(kāi)始。
方法
在整個(gè)過(guò)程中使用空白樣品，以測(cè)量從試劑到殘留物的任何貢獻(xiàn)。
1. 稱取兩份1g樣品，精確至0.1mg，放入400ml高型燒杯中。樣品重量的差異應(yīng)小于
彼此各20毫克。向每個(gè)燒杯中添加50毫升磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），并用pH計(jì)檢查pH值。如果pH值不等于6.0±0.1，則進(jìn)行調(diào)整。
2. 加入50µL熱穩(wěn)定α-淀粉酶溶液。
3. 在燒杯上蓋上鋁箔，放入沸水浴中。燒杯必須在98-100°C下培養(yǎng)15分鐘。每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)。
注：當(dāng)槽中燒杯的數(shù)量使燒杯內(nèi)容物難以達(dá)到98-100°C的內(nèi)部溫度時(shí)，應(yīng)增加培養(yǎng)時(shí)間。使用溫度計(jì)指示
在98-100°C下達(dá)到15分鐘。在沸水浴中總共30分鐘應(yīng)足夠。
4. 室溫下冷卻溶液。
5. 通過(guò)添加10 mL 0.275 N NaOH溶液將pH值調(diào)整至7.5±0.1。用pH計(jì)檢查pH值。
6. 加入100µL蛋白酶溶液。
7. 用鋁箔蓋住燒杯，在60°C下培養(yǎng)，連續(xù)攪拌30分鐘。
8. 冷卻并添加10 mL 0.325 N HCl溶液，以調(diào)節(jié)pH至
4.5±0.2。用pH計(jì)檢查pH值。
9. 加入200µL淀粉葡萄糖苷酶，蓋上鋁箔，在60°C下連續(xù)攪拌培養(yǎng)30分鐘。
10. 添加280毫升95%乙醇，預(yù)熱至60°C（加熱前測(cè)量體積）。讓沉淀在室溫下形成
60分鐘。
11. 稱取含有硅藻土的坩堝，精確至0.1 mg，然后使用洗滌瓶中78%的EtOH氣流濕潤(rùn)并分配坩堝中的硅藻土層。
12. 用吸力將硅藻土拉到燒結(jié)玻璃上，使其成為均勻的墊子。保持吸力，并將沉淀從酶消化液中定量轉(zhuǎn)移到坩堝中。
13. 用三份20ml的
78%乙醇，兩份10毫升95%乙醇和兩份
10毫升丙酮。在某些情況下，可能會(huì)形成牙齦
過(guò)濾過(guò)程中，將液體截留在殘?jiān)�。如果是這樣，用抹刀打破表面薄膜，以提高過(guò)濾效果。在整個(gè)過(guò)濾過(guò)程中，小心的間歇抽吸可以避免較長(zhǎng)的過(guò)濾時(shí)間。
14. 在70°C真空烘箱或105°C空氣烘箱中干燥含有殘留物的坩堝過(guò)夜。
15. 在干燥器中冷卻并稱重，精確至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土的重量，以確定殘留物的重量。
16. 采用AACC方法46-13，以N×6.25為轉(zhuǎn)換因子，分析一組重復(fù)樣品中的蛋白質(zhì)殘留。
17. 在525°C下將第二份殘留物樣品焚燒5 h。在干燥器中冷卻并稱重至0.1 mg。減去坩堝和硅藻土重量以測(cè)定灰分。
圖3。總膳食纖維分析方案。
計(jì)算：
| 未腐蝕av空白殘留物（UABR）= | 影音留白 |
| 空白（從步驟15開(kāi)始），mg | |
| 空白蛋白殘基（BPR）= | 空白中UABR x%蛋白質(zhì) |
| （步驟16）/100 | |
| 空白灰渣（BAR）= | UABR x%灰分空白 |
| （步驟17）/100 | |
| 校正空白（CB）= | UABR-BPR-BAR |
| 未腐蝕av樣品殘留量（USAR）= | Av樣品復(fù)本殘留量 |
| 樣品（步驟15）mg | |
| 樣品蛋白質(zhì)殘留（SPR）= | 樣品中的USAR x%蛋白質(zhì) |
| （步驟16）/100 | |
| 樣品灰渣（SAR）= | 樣品中的USAR x%灰分 |
| （步驟17）/100 | |
| 校正樣品殘留量（CSR）= | USAR-SPR-SAR-CB |
| %TDF公司= | 100 x CSR/mg樣品 |
提示：這些計(jì)算可以通過(guò)使用Megazyme Mega Calc來(lái)簡(jiǎn)化，可以從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com網(wǎng)站). 另請(qǐng)參閱本手冊(cè)第9頁(yè)。TM公司
參考文獻(xiàn)：
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2. 官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（1986年）。方法的改變。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)。《化學(xué)》，69370。
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4. 普羅斯基，L.，Asp，N.G.，弗爾達(dá)，I.，德弗里斯，J.W.，施維澤，T.F.和哈蘭，B.F.（1985年）。食品和食品中總膳食纖維的測(cè)定：合作研究。J、 助理關(guān)閉。肛門(mén)。化學(xué)，68677。
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活性和純度的測(cè)量
用于總膳食纖維測(cè)量的酶
為了成功應(yīng)用AACC/AOAC國(guó)際膳食纖維分析程序，所用的酶必須具有所需的活性，并且沒(méi)有重要的污染活性。迄今為止遇到的一些問(wèn)題包括：
a、 纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶污染淀粉葡萄糖苷酶（導(dǎo)致β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和果膠降解和低估）。
b、 不同濃度的耐熱α-淀粉酶（影響抗性淀粉的測(cè)量）（見(jiàn)參考文獻(xiàn)1）。
c、 蛋白酶受到1,3:1,4-β-葡聚糖酶的污染（導(dǎo)致對(duì)β-葡聚糖的低估）。
所需活動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)化：
根據(jù)AACC/AOAC國(guó)際膳食纖維測(cè)定中α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和蛋白酶的使用歷史，準(zhǔn)確可靠測(cè)量所需的活性為：
淀粉葡萄糖苷酶（黑曲霉）；每次檢測(cè)0.2毫升。
3300單位/毫升（用還原糖測(cè)定可溶性淀粉）或
200單位/毫升（AMG分析試劑；過(guò)量β-葡萄糖苷酶存在下的pNP-β-麥芽糖苷）。
耐熱α-淀粉酶（地衣芽孢桿菌）；每次測(cè)定0.05毫升。
10000 U/mL（用還原糖測(cè)定可溶性淀粉）或3000 U/mL（Ceralpha試劑；在耐熱α-葡萄糖苷酶存在下阻斷對(duì)硝基苯基麥芽庚糖苷）。
蛋白酶（地衣芽孢桿菌；枯草桿菌素A）；每次檢測(cè)0.10毫升。350酪氨酸單位/mL。（50毫克/毫升；7個(gè)酪氨酸單位/毫克）（用酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定酪蛋白）。
另外，蛋白酶可以方便地用偶氮酪蛋白（Megazyme cat）進(jìn)行檢測(cè)。編號(hào)S-AZCAS）。
更多詳情：
McCleary，B.V.（1999年）。纖維酶純度和活性測(cè)定。谷物食品世界，44（8），590-596。
重要污染活動(dòng)：
1在淀粉葡萄糖苷酶制劑中：
對(duì)用于膳食纖維測(cè)定的淀粉葡萄糖苷酶制劑的評(píng)價(jià)表明，許多制劑（除了純度很高、價(jià)格昂貴的制劑外）含有大量的污染β-葡聚糖酶（纖維素酶）。在某些制劑中，這種污染高達(dá)1%（以活性計(jì)），并導(dǎo)致β-葡聚糖的低估高達(dá)10-15%。淀粉葡萄糖苷酶中的纖維素酶污染可以通過(guò)以大麥β-葡聚糖為底物的粘度學(xué)研究或通過(guò)使用Megazymeβ-葡聚糖酶測(cè)試片（用于β-葡聚糖酶和纖維素酶的測(cè)量）來(lái)最好地證明和估計(jì)。
淀粉葡萄糖苷酶的纖維素酶污染對(duì)β-葡聚糖粘度（即分子大�。┑挠绊懭鐖D4所示。將大麥β-葡聚糖（10 mL，10 mg/mL）置于醋酸鈉緩沖液（50 mM，pH 4.5）中，在40℃下在C型U形管粘度計(jì)中與淀粉葡萄糖苷酶（TDF分析中使用的0.2 mL制劑）一起培養(yǎng)。在不同的時(shí)間間隔進(jìn)行粘度測(cè)量，比粘度計(jì)算為（t-t）/t，其中t是溶劑的流動(dòng)時(shí)間，t是消化液的流動(dòng)時(shí)間。ooo
比較了兩種酶制劑：
A。Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）（與用于TDF測(cè)定的其他商業(yè)制劑的AMG濃度相同）。
B。另一種市售淀粉葡萄糖苷酶制劑，推薦用于膳食纖維測(cè)定。
很明顯，Megazyme淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）基本上沒(méi)有污染β-葡聚糖酶，而另一種制劑含有大量的這種污染物。
2在蛋白酶制劑中：
蛋白酶被（1,3）（1,4）-β-葡聚糖酶污染的程度可使用淀粉葡萄糖苷酶中纖維素酶的測(cè)量程序進(jìn)行測(cè)定，修改后測(cè)定pH值為7.5（磷酸鈉緩沖液，50 mM）。
三。在α-淀粉酶制劑中：
耐熱α-淀粉酶無(wú)污染酶活性。
圖4。以大麥β-葡聚糖為底物的粘度計(jì)測(cè)定淀粉葡萄糖苷酶制劑中的纖維素酶污染（參考正文）。
A、 巨酶淀粉葡萄糖苷酶（E-AMGDF）。
B、 另一種用于膳食纖維測(cè)定的淀粉葡萄糖苷酶制劑。
標(biāo)簽：
總膳食纖維檢測(cè)
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