引言
表面等離子體共振儀器可以提供例如動力學、親和力和濃度等豐富的信息。P4SPR分子互作儀具有兩種不同類型的設(shè)置，可以進行靜態(tài)和動力學 SPR 分析。在靜態(tài)系統(tǒng)中，樣品溶液通過注射器手動引入流動池并通過擴散與表面發(fā)生相互作用。在動力學系統(tǒng)中，（通過手動注射器或自動進樣器）將樣品溶液先裝入樣品環(huán)，然后通過注射泵將運行緩沖液流過樣品環(huán)，將樣品引入流動池中。

本文描述了固定化多克隆鼠抗人 IgG (MAH IgG) 與全人 IgG (Hm IgG) 在靜態(tài)和動態(tài) Affinite Instruments SPR 設(shè)備之間的生物分子相互作用。

讓我們首先定義基本的親和力和動力學參數(shù)。使用基本的 Langmuir 結(jié)合模型假設(shè)固定配體 (L) 與分析物 (A) 相互作用的比例為 1:1。

A+L⇌AL             (1)

速率常數(shù) (k_on 和 k_off) 分別表示正向 (結(jié)合) 和反向 (解離) 反應(yīng)。解離平衡常數(shù) K_D 表示一半表面固定配體與分析物結(jié)合的時間，可以用游離分析物 [A]、配體 [L] 和分析物-配體復(fù)合物 [AL] 的濃度來表示 (等式 2)。或者，K_D 可以使用速率常數(shù) k_on 和 k_off（或者 k_a 和 k_d）來定義 (等式 2)：

KD 通常是作為求解參數(shù)的首選，因為它以摩爾濃度 (M) 表示，而締合平衡常數(shù) KA 以 M^-1 表示。

P4SPR分子互作儀靜態(tài)與動態(tài)SPR分析
動力學分析和靜態(tài)分析均以不同的方式提供有價值的信息。

動力學分析使我們能夠了解分子相互作用的動態(tài)，因為它可以洞悉結(jié)合的速度和強度。它有助于研究生物過程的機制并開發(fā)靶向療法。通過實時監(jiān)測相互作用，我們可以評估結(jié)合率和解離率并得出親和常數(shù)。

另一方面，靜態(tài)分析非常適合分析物的篩選和定量。它提供了特定時間點的結(jié)合快照，允許快速分析大量樣本集。由于簡化的樣品引入過程、更快的基線建立和高效的系統(tǒng)沖洗，靜態(tài) SPR 中的檢測時間最多可以是動態(tài) SPR 的一半。這使得靜態(tài) SPR 成為特異性篩選、分析物定量和基本親和力表征的省時選擇。

通過利用動力學和靜態(tài)分析，我們可以全面了解分子相互作用。動力學分析有助于我們揭示結(jié)合的動態(tài)方面，而靜態(tài)分析則可以進行有效的篩選和量化。它們共同提供了結(jié)合過程的整體視圖，從初始關(guān)聯(lián)到穩(wěn)態(tài)結(jié)合水平。
 

表 1 靜態(tài)和動態(tài)SPR 實驗?zāi)Ｊ街�間的特征比較

圖 1 P4SPR 2.0圖
 

圖 2 P4PRO圖

圖 3 分子結(jié)合事件的方案

結(jié)果
在靜態(tài) SPR 中，只能觀察到結(jié)合階段。圖 4 中顯示了典型的圖形疊加。隨著分析物與固定在表面上的配體結(jié)合，信號逐漸增加。一旦大多數(shù)可用的配體位點被占據(jù)，信號就會達到稱為穩(wěn)定狀態(tài)的平臺，此時配體和分析物結(jié)合和解離之間達到平衡。曲線的形狀和動力學還可以提供有關(guān)結(jié)合親和力、結(jié)合速率和分析物-配體相互作用的化學計量的定性信息。圖 5 中繪制了 SPR 偏移值與濃度的關(guān)系，并通過 Affinité 的 ezControl 軟件獲得了曲線擬合。
 

圖 4 編制不同濃度 (0、0.89、2.7、8.0、24、72nM) 的 Hm IgG 與參考通道調(diào)整后的固定化 MAH IgG 結(jié)合的靜態(tài) SPR 傳感圖
 

圖 5 通過繪制 RU 中的 SPR 偏移與納摩爾濃度的關(guān)系圖，可以對 ezControl 軟件中的 KD 進行靜態(tài)評估

通過此曲線擬合，在 63RU 處評估 Rmax，在 ½ Rmax (KD) 處評估濃度為 4.9nM。

在動力學 SPR 中，結(jié)合和解離階段都是可觀察到的。圖 6 顯示了 Hm IgG 動力學注射的圖形疊加。在結(jié)合階段，分析物被注入并允許其與固定在表面上的配體結(jié)合。隨著結(jié)合的發(fā)生，SPR 傳感圖上的信號逐漸增加。信號增加的速率反映了結(jié)合速率常數(shù) (ka)，這表明結(jié)合發(fā)生的速度。結(jié)合階段使我們能夠?qū)崟r監(jiān)測分析物-配體復(fù)合物的形成。

結(jié)合階段之后，解離階段開始。在此階段，分析物被運行緩沖液取代，傳感圖上的信號開始減弱。信號減弱的速率反映了解離速率常數(shù) (kd)，這表明分析物-配體復(fù)合物解離的速度。解離階段使我們能夠觀察結(jié)合的穩(wěn)定性并測量解離速率。

SPR 中的曲線形狀取決于結(jié)合動力學和分析物與配體之間的親和力。在典型的結(jié)合場景中，在結(jié)合階段，傳感圖上的信號迅速增加，直到達到穩(wěn)定狀態(tài)，這表明大多數(shù)可用的配體位點已被占用。信號達到穩(wěn)定狀態(tài)的速率取決于結(jié)合速率常數(shù) (ka) 和分析物的濃度。
 

圖 6 編制不同濃度 (0、0.89、2.7、8.0、24、72nM) 的 Hm IgG 與用參考通道和空白調(diào)整的固定化 MAH IgG 結(jié)合的動力學 SPR 傳感圖

圖 7 顯示了動力學數(shù)據(jù)的描跡擬合：它表示兩個連接段，分別代表結(jié)合速率和解離速率。結(jié)合速率斜率相對較陡表明結(jié)合速度較快，而解離速率斜率較平緩表明解離速率較慢，表明抗體結(jié)合強。相反，斜率越陡，解離速率越快，抗體結(jié)合越弱。
 

圖 7 通過 TraceDrawer 評估動力學參數(shù)

表 2 提供了靜態(tài) SPR 和動態(tài) SPR 之間各種參數(shù)的比較。在動態(tài) SPR 中，分析物-配體相互作用的結(jié)合速率 (kon) 為 3.42 x 10^5 M^-1*s^-1，解離速率 (koff) 為 3.10 x 10^-4 s^-1，親和力 (KD) 值為 1 nM，最大結(jié)合響應(yīng) (Rmax) 為 83。在靜態(tài) SPR 中，kon 和 koff 速率不可觀察，Rmax 在 63RU 處評估，KD 評估為 5nM。靜態(tài)系統(tǒng)中分析物的停留時間越長，Rmax 投影就越高，因此與動態(tài)分析相比，KD 值越低，相關(guān)性越高。

表 2 通過 TraceDrawer 評估動力學參數(shù)（NA：不適用）

概括

從動態(tài) SPR 獲得的這些參數(shù)為生物分子相互作用提供了寶貴的見解。另一方面，靜態(tài) SPR 提供了一種更簡單、更具成本效益的方法來篩選和量化分析物。

雖然靜態(tài) SPR 與動態(tài) SPR 相比提供的參數(shù)較少，但它仍然可以在更短的時間內(nèi)產(chǎn)生類似的結(jié)果。靜態(tài) SPR 中簡化的樣品引入過程、更快的基線建立和高效的系統(tǒng)沖洗有助于提高其時間效率。此外，靜態(tài) SPR 儀器的簡化系統(tǒng)設(shè)計和較低成本使它們對許多研究人員來說更容易獲得和負擔得起.

總之，動態(tài) SPR 提供了一套全面的參數(shù)來表征生物分子相互作用，包括親和力、結(jié)合速率、解離速率和最大結(jié)合響應(yīng)。另一方面，靜態(tài) SPR 可以提供其中一些參數(shù)，例如親和力，并在更快、更簡單、更實惠的系統(tǒng)中提供類似的結(jié)果。動態(tài)和靜態(tài) SPR 之間的選擇取決于特定的實驗要求和從分析中尋求的信息。

關(guān)于 Affinity 儀器

加拿大Affinité Instruments是一家專注于分子互作研究的公司，基于無標記、高靈敏、表面等離子共振技術(shù)（SRP技術(shù)）開發(fā)了性價比極高的個人型分子互作儀，旨在讓每位科研工作者和實驗室都能夠順利的把分子互作相關(guān)實驗開展起來，助力生物科學發(fā)展。

P4PRO是Affinité Instruments最暢銷的一款分子互作儀，其特點是：
①基于SPR原理，實時、無標記、檢測相互作用；
②搭配先進的微流控技術(shù)，實現(xiàn)高性能和高準確性；
③10分鐘內(nèi)完成1個樣本測試；
④一組實驗可獲得結(jié)合特異性、親和力、動力學等數(shù)據(jù)；
⑤四通道檢測，結(jié)合參照通道信號，可進行背景扣除，獲得可信數(shù)據(jù)；
⑥儀器穩(wěn)定，操作簡單，維護簡便；
⑦采用注射泵組件，控制精準，信號穩(wěn)定；
⑧儀器性價比高，單個實驗室即可負擔；
⑨Afficoat^TM芯片可減少SPR試驗中的非特異性結(jié)合；
⑩芯片耗材成本低，大大降低儀器運行成本。