蛋白降解技術AUTOTAC、第一代和第二代AUTAC的作用機制
01
蛋白降解技術
在蛋白降解技術中，目前最具開發(fā)潛力的是利用泛素化-蛋白酶體途徑的靶向降解技術，其代表技術為 PROTAC。但蛋白酶體系統(tǒng)并不適用于所有蛋白的降解，如與神經退行性疾病相關的蛋白聚集體、較大體積的蛋白或非蛋白靶標，如脂滴等。
除蛋白酶體降解系統(tǒng)之外，溶酶體降解系統(tǒng)也是真核細胞中重要的降解途徑。由于溶酶體含有多種酸性水解酶，可降解包括蛋白、核酸、脂質在內的多種物質，很好地補充了蛋白酶體降解系統(tǒng)的不足。
圖 1. 基于自噬溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的自噬依賴靶向降解技術[1]。
(1) 以 PROTACs 和 AUTAC 為例，誘導感興趣目標 (TOIs) 和標記機制之間的接近，向 TOI 添加易于自噬的標簽，然后可以識別這些標簽;(2)如 TPA 和AUTOTACs，直接向 TOIs 招募識別機器；(3) 利用上游自噬機制或調節(jié)因子作為 MOIs，在 TOIs 位點觸發(fā)自噬體的生物發(fā)生；(4) 以 ATTECs 為代表的策略四將 TOIs 和 mATG8s 結合在一起，將 TOIs 連接到一個吞噬體上。
目前基于溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的靶向蛋白降解技術包括AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera)，AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera)，ATTEC (Autophagosome-tethering compound) (詳見：ATTEC 分子: 通過自噬降解多靶點的閃亮新星！)等。其中 AUTAC 、AUTOTAC 及 ATTEC 是利用自噬-溶酶體降解機制進行蛋白降解。
第一代/ 第二代 AUTAC & 第二代AUTOTAC
第一代 AUTAC 和第二代 AUTAC 既然都叫 AUTAC，所以降解機制是一樣的。
而 AUTAC 和 AUTOTAC 名字雖然很像，但二者從作用機制上還是存在差異的。AUTAC 是誘導底物打上泛素化標簽，底物受體通過泛素化標簽與底物結合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結合起來。
由于基于自噬溶酶體系統(tǒng)的蛋白降解技術的開發(fā)基礎是選擇性自噬機制，所以首先我們先了解一下選擇性自噬的機制。
02
選擇性自噬機制
選擇性自噬機制主要包括兩個過程：底物識別和分離膜招募[1]。其機制如下：
- 底物識別: 底物受體與底物結合，主要有兩種方式：(1) 通過降解標簽結合：識別機器 (底物受體，支架蛋白等) 結合底物表面的降解標簽。(2) 直接結合：識別機器直接與底物結合。
- 分離膜招募: 大部分底物受體都通過結合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜。除上述機制外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機器 (autophagy machinery) 及它們的調節(jié)蛋白，例如 ULK1 復合物與 BK1 等，以促進在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。
圖 2. 選擇性自噬作用機制[1]。
在底物一端，一些識別機器結合特定的降解標簽 (tag)，例如泛素、N-degron 或特定的糖鏈，這些標簽可以被修飾在底物表面，也可以由底物內部暴露出來；另一些底物受體可直接結合底物。在另一端，大部分底物受體都通過結合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜；除此之外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機器 (autophagy machinery) 及它們的調節(jié)蛋白，例如 ULK1 復合物與 TBK1 等，以促進在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。
03
AUTOTAC
AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera), 即自噬靶向嵌合體。AUTOTAC 包括三部分：目的蛋白配體、p62 靶向配體以及連接二者的 linker。
AUTOTAC 作用機制：
AUTOTAC 和 p62 的 ZZ 結構域結合，使得原本無活性的 p62 構象被激活誘導為自噬相容形式，暴露出 PB1 和 LIR 結構域，PB1 和 LIR 分別可以促進 p62 與靶蛋白復合物的自聚集及其與自噬膜上 LC3 的相互作用，從而誘導靶蛋白經過溶酶體降解[2]。其中p62就是一種底物受體，AUTOTAC通過將底物與受體連接，實現(xiàn)底物識別，進而被降解，所以AUTOTAC 的機制是介導底物受體與底物的結合，即底物識別中的直接結合機制。
研究表明，利用 AUTOTAC 技術可成功在體外和體內降解神經退行性病變中的癌蛋白和蛋白質聚集體。該技術的可行性為蛋白降解領域提供了一個新的策略。
研究人員首先針對 p62 的 ZZ 結構域進行 3D 建模，然后進行結構和活性研究，最終確定了 YOK-2204、YOK-1304 和 YTK-105 三種化合物，之后通過 PEG linker 將 p62-ZZ 配體和靶蛋白配體連接合成多種 AUTOTAC，并驗證了 AUTOTAC 不僅可以介導癌蛋白降解，還可以降解錯誤折疊蛋白即蛋白聚集體的降解[2]。
與 PROTAC 相比，PROTAC 實現(xiàn)靶蛋白的有效降解和 Linker 長度及類型密切相關，但 AUTOTAC 的效果或許并不特別的依賴于 Linker 的長度，這為 AUTOTAC 設計提供了更多的靈活性[2]。
圖 4. 自噬靶向配體作用模式的模型 (a) 與自噬靶向配體的化學結構 (b) [2]。
04
AUTAC
AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera) 主要由 3 部分組成，分別是靶蛋白配體、Linker 和降解標簽鳥嘌呤衍生物 (GD)。
AUTAC 的作用原理：通過降解標簽模擬 S-鳥苷酸化修飾，誘導靶蛋白的多聚泛素化，即給靶蛋白打上降解標簽，識別機器通過降解標簽與靶蛋白結合，實現(xiàn)底物識別。所以 AUTAC 機制不同于 AUTOTAC，是借助降解標簽實現(xiàn)底物識別。
AUTAC 具有更加廣泛的降解范圍，不僅可以降解細胞質蛋白，還可以實現(xiàn)降解個頭較大的細胞器，包括內質網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體等。
第一代 AUTAC
研究發(fā)現(xiàn)，在鏈球菌自噬清除過程中，S-鳥苷化在多泛素化過程中具有重要機制，然而具體的自噬機制仍然不清楚。基于之前研究背景，第一代 AUTACs 選擇鳥嘌呤衍生物 (cGMP) 作為自噬標簽來誘導內源性 S-鳥苷酸化。所有報道的第一代 AUTAC 化合物均具有半胱氨酸作為亞結構[3]。
第二代 AUTAC
第一代 AUTAC 的開發(fā)，主要集中在替代內源性 S-鳥苷化中發(fā)現(xiàn)的磷酸化核糖結構，因為 cGMP 的半胱氨酸亞結構會導致不必要的蛋白激酶 G (PKG) 激活。此外，環(huán)磷酸的負電荷可能會影響 AUTAC 細胞膜的通透性。
Hirokazu Arimoto 教授團隊基于此前研究背景對 AUTACs 進行了結構-活性關系 (SAR) 研究，分別對第一代 AUTAC 鳥嘌呤部位及半胱氨酸部位用不同結構進行替換，發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤在 AUTAC 中發(fā)揮重要作用，而用吡唑環(huán)替代半胱氨酸可以明顯提高 AUTAC 活性。第二代 AUTAC 與第一代 AUTAC 相比，其活性提高了 100 倍[4]。
05
小結
AUTAC 與 AUTOTAC 都是利用自噬-溶酶體降解機制進行蛋白降解，都是在底物識別階段介導蛋白降解，但具體的降解機制略有不同，AUTAC 是誘導底物打上泛素化標簽，底物受體通過泛素化標簽與底物結合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結合起來。
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參考文獻：
[1] Yiqing Zhang, et al. Manipulating autophagic degradation in human diseases: from mechanisms to interventions. 5 July 2022; Accepted: 8 October 2022. Life Medicine, 2022, Volume 1.
[2] Ji CH, et al. The AUTOTAC chemical biology platform for targeted protein degradation via the autophagy-lysosome system. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):904.
[3] Takahashi D, et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Mol Cell. 2019 Dec 5;76(5):797-810.e10.
[4] Takahashi D, et al. Second-Generation AUTACs for Targeted Autophagic Degradation. J Med Chem. 2023 Sep 14;66(17):12342-12372.
