細胞凋亡實驗中的討論熱點話題和常見疑問解答
上期 MCE 細胞凋亡主題直播的 Q&A 匯總來啦！希望能為您提供有價值的見解和實用技巧~還為您準備了萌家 《細胞凋亡實驗手冊》，干貨滿滿，附有相關產(chǎn)品支持您的凋亡相關實驗！快來隨小 M 一起來看看吧~
01
實驗手冊
叮叮~，針對上期教師節(jié)特約直播，小 M 為大家準備了干貨滿滿的 《細胞凋亡實驗手冊》，內(nèi)容涵蓋了細胞凋亡機制，各種經(jīng)典的檢測方法和相關檢測試劑，并有詳細的檢測 Protocol 助力您的實驗。
此外，MCE 還有更多產(chǎn)品指南，有需要的小伙伴可以速戳 ~
圖片丨MCE 產(chǎn)品指南
廢話不多說！我們一起來看看 上期凋亡直播的問答匯總吧~
02
Q&A匯總
在上次直播中，小 M 帶著大家深入解析了三種主要的細胞凋亡相關知識 (詳見往期直播：細胞凋亡：機制、標志物與檢測方法的解決方案)。
在和各位老師們的深入探討中，有許多老師提出了許多精彩的問題，小 M 也是精心整理了一份 Q&A 匯總，涵蓋了直播中討論的熱點話題和常見疑問，快來隨小 M 一起看一下吧~
01
眾多細胞檢測凋亡的方式，該選哪一個呢？為什么選電鏡 (TEM) 的比較少，而選 Western blot 的比較多？
檢測細胞凋亡的方法有很多種，選擇哪種方法需要考慮實驗目的、樣品類型、檢測靈敏度、特異性、操作難度等因素。
1. 電子顯微鏡 (TEM) 的優(yōu)勢在于可以觀察到細胞凋亡的典型形態(tài)學變化,如染色質(zhì)凝聚、細胞質(zhì)縮小、細胞膜皺縮等，以及細胞的超微結構，但需要專業(yè)設備和技術,操作復雜,樣品制備耗時。TEM 通常用于研究凋亡的形態(tài)學特征和機制，不適合大規(guī)模樣品檢測。
2. 常見的檢測方法是先用 Annexin V/PI 等方法進行初步驗證,再用 Western blot 等方法驗證關鍵蛋白的表達，Western blot 操作相對簡單,可定量分析。
02
我想檢測血小板凋亡，可以用哪種凋亡檢測方式？
血小板的凋亡標志物包括線粒體內(nèi)膜膜電位 (Δφm) 的去極化、細胞色素 c 的釋放、促凋亡和抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族的表達含量變化、Caspase-3 的激活、磷脂酰絲氨酸 (PS) 的暴露、血小板收縮、碎裂成微粒、血小板表面的水泡和絲狀足擠壓等 (PMID: 22383127)。常用的檢測方法包括流式細胞術、Western blot 分析和電子顯微鏡 (TEM)，是檢查各種生理和病理環(huán)境中血小板凋亡的有用工具。
03
Annexin V/PI 雙染的流式細胞術中,四個象限的細胞分別代表什么狀態(tài)？
左上象限 Q1：Annexin V-/PI+，一般是機械損傷的細胞，如果這個象限的細胞特別多，需要排除實驗操作異常。
右上象限 Q2：Annexin V+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞和壞死細胞。
右下象限 Q3：Annexin V+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。
左下象限 Q4：Annexin V-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。
04
凋亡的熒光檢測方法中，流式細胞術和熒光顯微鏡檢測哪個結果更準確一些呢？
在凋亡檢測中，流式細胞術和熒光顯微鏡檢測各有特點。
流式細胞術：可實現(xiàn)高通量分析，定量分析熒光強度，可實現(xiàn)對不同細胞群體的分析。但樣本處理相對復雜，可能導致細胞損失或結果偏差。
熒光顯微鏡：可以通過熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，提供形態(tài)學信息，操作簡單，適合小規(guī)模實驗。但通常只能分析有限數(shù)量的細胞，結果的統(tǒng)計學意義較低，通常用于定性，難以進行準確的定量分析。
05
JC-1 一直染不出來是什么原因？改如何優(yōu)化實驗？
建議增加陽性對照 CCCP (HY-100941)，對于大多數(shù)細胞，經(jīng) CCCP 處理后，線粒體膜電位會完全喪失，增加陽性對照可以 JC-1 失效或者實驗操作的問題，然后再針對性的優(yōu)化實驗。
06
衰老細胞的線粒體膜通透性也會發(fā)生改變，檢測膜電位能區(qū)分凋亡和衰老嗎？
膜電位變化并不是凋亡或衰老的唯一指標，建議結合其他檢測方法和生物標志物的分析 (如 Annexin V/PI 染色、Caspase 活性檢測、活性氧水平/β-gal 活性檢測等)，有助于更準確地評估細胞的生理狀態(tài)。
07
如果購買 MCE 細胞凋亡化合物庫，不用自己尋找目標化合物嗎？是否只需要提供靶點通路由 MCE 來幫忙找？如何僅篩選其中的部分化合物呢？
MCE 細胞凋亡化合物庫（HY-L003）收錄了 2,400+ 種凋亡相關產(chǎn)品，主要靶向凋亡信號通路種主要靶點，可以用于細胞凋亡信號通路及相關疾病的研究。
1. 如果您僅需要其中某些靶點或者信號通路的化合物，MCE 可根據(jù)您的需求進行匹配，定制您需要的化合物庫。另外，我們也提供一站式藥篩服務。
2. 如果您僅想篩選其中的部分化合物，也是可以根據(jù)您的需求定制的。比如，有些客戶只想做老藥，就可以保留 FDA 的，只想做新藥，就可以保留還沒上臨床的；比如有些客戶想要其中的代謝物或者天然產(chǎn)物等，因此，MCE 可根據(jù)您的需求來定制。
08
有的細胞凋亡抑制劑濃度過高或者處理時間過長會導致細胞死亡，應該怎么避免?
一般來說，細胞凋亡抑制劑可以抑制細胞內(nèi)發(fā)生的凋亡，但濃度過高或者處理時間長可能會對細胞產(chǎn)生非特異性毒性、細胞代謝紊亂、激活其他細胞死亡通路 (如壞死性凋亡、自噬等)，導致細胞死亡等。
建議您多查閱文獻，并設置濃度梯度實驗和時間梯度，選用文獻報道的凋亡特異性抑制劑，以減少對其他細胞生理過程的干擾，并注意觀察細胞的形態(tài)、增殖和存活情況，確定最佳實驗條件。
09
如果我想要通過抑制 P53 去抑制凋亡通路，有什么可用的抑制劑嗎？
有文獻表明，p53 可通過不同的途徑誘導細胞周期停滯和凋亡 (PMID: 29149101)，抑制 p53 的研究主要集中在小分子抑制劑（如 PFT-α）和 RNA 干擾技術。
PFT-α (HY-15484) 是一種小分子抑制劑，能夠特異性抑制 p53 的活性。它通過與 p53 結合，阻止其轉(zhuǎn)錄激活功能，從而減少 p53 依賴的凋亡。在多種細胞模型中，PFT-α 被證明可以降低因化療藥物引起的細胞死亡。
此外，使用小干擾 RNA (siRNA) 或反義寡核苷酸 (ASO) 來特異性降低 p53 的表達，從而抑制其介導的凋亡。
10
Caspase 的抑制劑是通用的嗎？在選擇凋亡抑制劑時該如何選擇？
Caspase 抑制劑是廣泛應用的細胞凋亡抑制劑，例如如 Ac-DEVD-cho, z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk, 分別靶向 Caspase 3、泛-Caspase、Caspase 8、Caspase 9。然而，某些細胞和組織并不表達某種或者多種 Caspase，因此，首先要確定你的樣本中 (細胞或者組織) 是否有表達這個 Caspase 蛋白，然后參考文獻中的處理濃度和時間，看文獻中有沒有相同或者類似的模型，最終確定選擇哪個抑制劑比較合適。
11
細胞凋亡和細胞壞死能夠同時存在嗎？
細胞凋亡和細胞壞死能夠同時存在。
細胞死亡是一個復雜的生物學現(xiàn)象，細胞凋亡和細胞壞死是兩種不同的細胞死亡方式，細胞在不同的刺激下可能會經(jīng)歷不同的死亡途徑。但細胞凋亡和細胞壞死也有共同存在的機制。
1. 在某些情況下，細胞可能同時經(jīng)歷凋亡和壞死。例如，在嚴重的氧化應激或細胞損傷下，細胞可能首先激活凋亡通路，但由于損傷過于嚴重或時間過長，最終轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?/span> (PMID: 11035261)。
2. 細胞凋亡和壞死的信號通路之間存在交叉。例如，在炎癥性疾病中，某些炎癥因子或細胞因子可以同時激活凋亡和壞死的相關信號通路 (PMID: 11997180)。
3. 在某些疾病 (如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等) 中，細胞凋亡和壞死也有可能同時發(fā)生，影響疾病的進展和治療效果。
12
確定凋亡的發(fā)生后是否有必要確定是內(nèi)源或者外源的？
在某些情況下是必要的，確定是內(nèi)源性還是外源性的有助于研究細胞發(fā)生凋亡的具體機制，有助于藥物發(fā)現(xiàn)的研究。
例如，確定抗癌藥物誘導癌細胞凋亡的具體途徑可以明確抗癌機制，對臨床上的用藥具有一定的指導意義 (PMID: 33879127)。此外，凋亡的失調(diào)會導致疾病的發(fā)生，確定凋亡的具體機制有助于研究疾病的發(fā)病機制，助力藥物開發(fā)。比如，F(xiàn)as 信號通路缺陷的 Lpr 和 gld 小鼠會出現(xiàn)淋巴結腫大和脾腫大，并發(fā)展出一種類似于人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 的疾病，表明外源性凋亡通路在自身免疫病研究中發(fā)揮著重要作用 (PMID: 22683550)。
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此外，MCE 還有更多產(chǎn)品指南，有需要的小伙伴可以速戳 ~
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02
Q&A匯總
在上次直播中，小 M 帶著大家深入解析了三種主要的細胞凋亡相關知識 (詳見往期直播：細胞凋亡：機制、標志物與檢測方法的解決方案)。
在和各位老師們的深入探討中，有許多老師提出了許多精彩的問題，小 M 也是精心整理了一份 Q&A 匯總，涵蓋了直播中討論的熱點話題和常見疑問，快來隨小 M 一起看一下吧~
01
眾多細胞檢測凋亡的方式，該選哪一個呢？為什么選電鏡 (TEM) 的比較少，而選 Western blot 的比較多？
檢測細胞凋亡的方法有很多種，選擇哪種方法需要考慮實驗目的、樣品類型、檢測靈敏度、特異性、操作難度等因素。
1. 電子顯微鏡 (TEM) 的優(yōu)勢在于可以觀察到細胞凋亡的典型形態(tài)學變化,如染色質(zhì)凝聚、細胞質(zhì)縮小、細胞膜皺縮等，以及細胞的超微結構，但需要專業(yè)設備和技術,操作復雜,樣品制備耗時。TEM 通常用于研究凋亡的形態(tài)學特征和機制，不適合大規(guī)模樣品檢測。
2. 常見的檢測方法是先用 Annexin V/PI 等方法進行初步驗證,再用 Western blot 等方法驗證關鍵蛋白的表達，Western blot 操作相對簡單,可定量分析。
02
我想檢測血小板凋亡，可以用哪種凋亡檢測方式？
血小板的凋亡標志物包括線粒體內(nèi)膜膜電位 (Δφm) 的去極化、細胞色素 c 的釋放、促凋亡和抗凋亡蛋白 Bcl-2 家族的表達含量變化、Caspase-3 的激活、磷脂酰絲氨酸 (PS) 的暴露、血小板收縮、碎裂成微粒、血小板表面的水泡和絲狀足擠壓等 (PMID: 22383127)。常用的檢測方法包括流式細胞術、Western blot 分析和電子顯微鏡 (TEM)，是檢查各種生理和病理環(huán)境中血小板凋亡的有用工具。
03
Annexin V/PI 雙染的流式細胞術中,四個象限的細胞分別代表什么狀態(tài)？
左上象限 Q1：Annexin V-/PI+，一般是機械損傷的細胞，如果這個象限的細胞特別多，需要排除實驗操作異常。
右上象限 Q2：Annexin V+/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞和壞死細胞。
右下象限 Q3：Annexin V+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。
左下象限 Q4：Annexin V-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。
04
凋亡的熒光檢測方法中，流式細胞術和熒光顯微鏡檢測哪個結果更準確一些呢？
在凋亡檢測中，流式細胞術和熒光顯微鏡檢測各有特點。
流式細胞術：可實現(xiàn)高通量分析，定量分析熒光強度，可實現(xiàn)對不同細胞群體的分析。但樣本處理相對復雜，可能導致細胞損失或結果偏差。
熒光顯微鏡：可以通過熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，提供形態(tài)學信息，操作簡單，適合小規(guī)模實驗。但通常只能分析有限數(shù)量的細胞，結果的統(tǒng)計學意義較低，通常用于定性，難以進行準確的定量分析。
05
JC-1 一直染不出來是什么原因？改如何優(yōu)化實驗？
建議增加陽性對照 CCCP (HY-100941)，對于大多數(shù)細胞，經(jīng) CCCP 處理后，線粒體膜電位會完全喪失，增加陽性對照可以 JC-1 失效或者實驗操作的問題，然后再針對性的優(yōu)化實驗。
06
衰老細胞的線粒體膜通透性也會發(fā)生改變，檢測膜電位能區(qū)分凋亡和衰老嗎？
膜電位變化并不是凋亡或衰老的唯一指標，建議結合其他檢測方法和生物標志物的分析 (如 Annexin V/PI 染色、Caspase 活性檢測、活性氧水平/β-gal 活性檢測等)，有助于更準確地評估細胞的生理狀態(tài)。
07
如果購買 MCE 細胞凋亡化合物庫，不用自己尋找目標化合物嗎？是否只需要提供靶點通路由 MCE 來幫忙找？如何僅篩選其中的部分化合物呢？
MCE 細胞凋亡化合物庫（HY-L003）收錄了 2,400+ 種凋亡相關產(chǎn)品，主要靶向凋亡信號通路種主要靶點，可以用于細胞凋亡信號通路及相關疾病的研究。
1. 如果您僅需要其中某些靶點或者信號通路的化合物，MCE 可根據(jù)您的需求進行匹配，定制您需要的化合物庫。另外，我們也提供一站式藥篩服務。
2. 如果您僅想篩選其中的部分化合物，也是可以根據(jù)您的需求定制的。比如，有些客戶只想做老藥，就可以保留 FDA 的，只想做新藥，就可以保留還沒上臨床的；比如有些客戶想要其中的代謝物或者天然產(chǎn)物等，因此，MCE 可根據(jù)您的需求來定制。
08
有的細胞凋亡抑制劑濃度過高或者處理時間過長會導致細胞死亡，應該怎么避免?
一般來說，細胞凋亡抑制劑可以抑制細胞內(nèi)發(fā)生的凋亡，但濃度過高或者處理時間長可能會對細胞產(chǎn)生非特異性毒性、細胞代謝紊亂、激活其他細胞死亡通路 (如壞死性凋亡、自噬等)，導致細胞死亡等。
建議您多查閱文獻，并設置濃度梯度實驗和時間梯度，選用文獻報道的凋亡特異性抑制劑，以減少對其他細胞生理過程的干擾，并注意觀察細胞的形態(tài)、增殖和存活情況，確定最佳實驗條件。
09
如果我想要通過抑制 P53 去抑制凋亡通路，有什么可用的抑制劑嗎？
有文獻表明，p53 可通過不同的途徑誘導細胞周期停滯和凋亡 (PMID: 29149101)，抑制 p53 的研究主要集中在小分子抑制劑（如 PFT-α）和 RNA 干擾技術。
PFT-α (HY-15484) 是一種小分子抑制劑，能夠特異性抑制 p53 的活性。它通過與 p53 結合，阻止其轉(zhuǎn)錄激活功能，從而減少 p53 依賴的凋亡。在多種細胞模型中，PFT-α 被證明可以降低因化療藥物引起的細胞死亡。
此外，使用小干擾 RNA (siRNA) 或反義寡核苷酸 (ASO) 來特異性降低 p53 的表達，從而抑制其介導的凋亡。
10
Caspase 的抑制劑是通用的嗎？在選擇凋亡抑制劑時該如何選擇？
Caspase 抑制劑是廣泛應用的細胞凋亡抑制劑，例如如 Ac-DEVD-cho, z-VAD-fmk, Z-IETD-fmk, Z-LEHD-fmk, 分別靶向 Caspase 3、泛-Caspase、Caspase 8、Caspase 9。然而，某些細胞和組織并不表達某種或者多種 Caspase，因此，首先要確定你的樣本中 (細胞或者組織) 是否有表達這個 Caspase 蛋白，然后參考文獻中的處理濃度和時間，看文獻中有沒有相同或者類似的模型，最終確定選擇哪個抑制劑比較合適。
11
細胞凋亡和細胞壞死能夠同時存在嗎？
細胞凋亡和細胞壞死能夠同時存在。
細胞死亡是一個復雜的生物學現(xiàn)象，細胞凋亡和細胞壞死是兩種不同的細胞死亡方式，細胞在不同的刺激下可能會經(jīng)歷不同的死亡途徑。但細胞凋亡和細胞壞死也有共同存在的機制。
1. 在某些情況下，細胞可能同時經(jīng)歷凋亡和壞死。例如，在嚴重的氧化應激或細胞損傷下，細胞可能首先激活凋亡通路，但由于損傷過于嚴重或時間過長，最終轉(zhuǎn)變?yōu)閴乃?/span> (PMID: 11035261)。
2. 細胞凋亡和壞死的信號通路之間存在交叉。例如，在炎癥性疾病中，某些炎癥因子或細胞因子可以同時激活凋亡和壞死的相關信號通路 (PMID: 11997180)。
3. 在某些疾病 (如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等) 中，細胞凋亡和壞死也有可能同時發(fā)生，影響疾病的進展和治療效果。
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確定凋亡的發(fā)生后是否有必要確定是內(nèi)源或者外源的？
在某些情況下是必要的，確定是內(nèi)源性還是外源性的有助于研究細胞發(fā)生凋亡的具體機制，有助于藥物發(fā)現(xiàn)的研究。
例如，確定抗癌藥物誘導癌細胞凋亡的具體途徑可以明確抗癌機制，對臨床上的用藥具有一定的指導意義 (PMID: 33879127)。此外，凋亡的失調(diào)會導致疾病的發(fā)生，確定凋亡的具體機制有助于研究疾病的發(fā)病機制，助力藥物開發(fā)。比如，F(xiàn)as 信號通路缺陷的 Lpr 和 gld 小鼠會出現(xiàn)淋巴結腫大和脾腫大，并發(fā)展出一種類似于人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE) 的疾病，表明外源性凋亡通路在自身免疫病研究中發(fā)揮著重要作用 (PMID: 22683550)。
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Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒 (HY-K1073) 凋亡檢測試劑盒，F(xiàn)ITC: 488/525 nm; PI: 535/617 nm。 |
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線粒體膜電位試劑盒，可用于早期細胞凋亡檢測。 |
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Cleaved-Caspase 3 p12 antibody (HY-P80623) 凋亡檢測抗體。Caspase-3 在凋亡時被剪切成 p17 和 p12 的兩個片段。 |
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Bcl-2 抑制劑，引發(fā)內(nèi)源性凋亡。 |
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Caspase 3 抑制劑，凋亡抑制劑。 |
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泛-Caspase 抑制劑，凋亡抑制劑。 |
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2,400+ 種凋亡相關產(chǎn)品，靶向凋亡信號通路種主要靶點。 |
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