RNA 干擾技術(shù)是研究基因功能的一種強(qiáng)大工具，這種技術(shù)有可能直接從源頭上讓致病基因“沉默”。今天就讓我們一起來(lái)學(xué)習(xí)如何做 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)！

RNA干擾 (RNA interference, RNAi) 是指一種高度保守的細(xì)胞機(jī)制，其中Argonaute (Ago) 家族蛋白結(jié)合小 RNA，通過(guò)小 RNA 和靶 RNA 之間的序列互補(bǔ)性觸發(fā)較長(zhǎng) RNA (即靶 RNA) 的降解。RNAi 機(jī)制首次由 Andrew Z. Fire、Craig C. Mello 及其同事在線蟲(chóng) (Caenorhabditis elegans) 中描述，也因此獲得了 2006 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，RNAi 已迅速發(fā)展成為一種強(qiáng)大的反向遺傳學(xué)工具，用于在細(xì)胞和生物體水平上研究基因功能、調(diào)控和相互作用。在昆蟲(chóng)和其他動(dòng)物中，已知有三類(lèi)不同的小 RNA 可觸發(fā)三條相應(yīng)的 RNAi 途徑：siRNAs、miRNAs 以及 piRNAs。
接下來(lái) 為大家介紹 siRNA 干擾途徑！


siRNA 是一種小的雙鏈 RNA (dsRNA)，約有 20-25 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，可以觸發(fā) RNA 干擾機(jī)制。長(zhǎng)雙鏈 RNA 在被 Dcr2 與 R2D2 或 Loqs 切割成短雙鏈 RNA。短雙鏈 RNA 解旋后正義鏈被降解。

反義鏈與多種蛋白組分 (如 Ago2) 形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)。RISC 中保留的反義鏈與靶基因的 mRNA 特異地互補(bǔ)，同時(shí) RISC 具有核酸酶活性，能將靶基因的 mRNA 切割降解，抑制靶基因的表達(dá)。

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設(shè)計(jì) siRNA

如果您希望設(shè)計(jì)自己的 siRNA，可根據(jù)以下原則來(lái)設(shè)計(jì) siRNA[3][4][5]。然后，通過(guò)化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、載體或 PCR 產(chǎn)物表達(dá)等方式進(jìn)行制備相應(yīng)的 siRNA。

一些在線網(wǎng)站可以基于一定規(guī)則設(shè)計(jì)出 siRNA 序列。如，http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html； 
http://sidirect2.rnai.jp/。
設(shè)計(jì)規(guī)則如下：
(1) 從靶基因轉(zhuǎn)錄本 (mRNA) 的 AUG 起始密碼子開(kāi)始，尋找“AA”及之后 3'端相鄰的 19 個(gè)堿基序列，作為潛在的 siRNA 靶向位點(diǎn)。
(2) siRNA 序列的 GC 含量應(yīng)為 30%-60% 左右。
(3) siRNA 中應(yīng)避免連續(xù)的單一堿基和反向重復(fù)序列。
(4) 避免針對(duì) 5'和 3'端的非編碼區(qū) (untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些 UTR 結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響沉默復(fù)合體結(jié)合 mRNA， 進(jìn)而影響 siRNA 的效果。
(5) 將潛在的靶向位點(diǎn)與相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (人、小鼠、大鼠等) 進(jìn)行對(duì)比，如果靶向序列與其他基因編碼序列具有超過(guò) 16-17 個(gè)連續(xù)堿基對(duì)同源性，就不能選擇這樣的序列。我們建議使用 BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
(6) 隨機(jī)設(shè)計(jì)的 siRNA 存在降低靶向基因的 mRNA 水平效果不佳的可能性，所以一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶基因的 siRNA，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)最有效的 siRNA 序列。

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siRNA 套裝

為了滿足廣大研究者利用 RNA干擾的方法去探究基因功能的需求，MedChemExpress (MCE) 專(zhuān)門(mén)推出預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 套裝。

我們的預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 套裝針對(duì)靶基因 (僅限人、小鼠、大鼠) 的不同區(qū)域設(shè)計(jì)三對(duì) siRNA，我們保證在標(biāo)準(zhǔn)使用條件下 (轉(zhuǎn)染效率 80% 以上) 至少一對(duì) siRNA 的 mRNA 水平沉默效率達(dá) 70% 以上。套裝產(chǎn)品包括 3 對(duì) siRNA，附贈(zèng)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、FAM 標(biāo)記陰性對(duì)照 siRNA。


 Tips：

• MCE 提供的 siRNA 為凍干粉形式，收到產(chǎn)品后，請(qǐng)于 -20℃ 或 -80℃ 保存，可以穩(wěn)定保存一年。
• 使用前瞬時(shí)離心，用 RNase-free H₂O 或滅菌 ddH₂O 配制成 20 μM 儲(chǔ)存液。
• 配置 20 μM 儲(chǔ)存液需要向 5 nmol 的 siRNA 中加入 250 μL 滅菌水。
• 20 μM 儲(chǔ)存液分裝保存避免反復(fù)凍融。
• 熒光標(biāo)記的 siRNA 需要避光保存。

 

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siRNA 轉(zhuǎn)染

常見(jiàn)轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE 葡聚糖和 polybrene、機(jī)械法 (例如，顯微注射和基因槍)、陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，其中使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染是目前最常用的轉(zhuǎn)染方法。
MCE 推出最新轉(zhuǎn)染試劑 HY-K2017 (siRNA/miRNA Transfection Reagent)，可用于高效率轉(zhuǎn)染 siRNA。對(duì)于一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、干細(xì)胞和 B 細(xì)胞系，可以考慮選擇電穿孔法。

  轉(zhuǎn)染步驟如下：
1. 接種細(xì)胞：待達(dá)到合適的細(xì)胞密度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
2. 制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：用無(wú)血清的培養(yǎng)基中稀釋 siRNA 儲(chǔ)存液和轉(zhuǎn)染試劑 HY-K2017，然后混合兩者，室溫孵育 15-30 min。
3. 轉(zhuǎn)染：向細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物和無(wú)血清培養(yǎng)基， 可在轉(zhuǎn)染約 6 h 后將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為正常含血清培養(yǎng)基，然后培養(yǎng) 24-96 h 后，收樣檢測(cè)。
4. siRNA 效果驗(yàn)證：常用方法是 RT-PCR 檢測(cè)靶基因 mRNA 水平或 Western 檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)水平。
MCE 的預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 套裝針提供了陰性對(duì)照、GAPDH 陽(yáng)性對(duì)照、FAM 標(biāo)記陰性對(duì)照。陰性對(duì)照與目的基因的序列無(wú)同源性，可用于驗(yàn)證 siRNA 的特異性。

圖 4. 檢測(cè) siRNA 的轉(zhuǎn)染效率^[6]。 

 

此外，客戶可以通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了 FAM 標(biāo)記陰性對(duì)照的細(xì)胞的熒光信號(hào)來(lái)確定轉(zhuǎn)染效率 (圖 3)。通過(guò)轉(zhuǎn)染了 GAPDH 陽(yáng)性對(duì)照的細(xì)胞確認(rèn)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中操作是否有問(wèn)題。如果 GAPDH mRNA 表達(dá)降低，則證明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中操作沒(méi)有問(wèn)題，GAPDH siRNA 正常發(fā)揮作用。如果 GAPDH mRNA 表達(dá)沒(méi)有變化，則證明操作出現(xiàn)失誤，轉(zhuǎn)染失敗。

▐ 1. 針對(duì)人類(lèi)基因設(shè)計(jì)的 siRNA 對(duì)其他物種是否也有效？
一般 siRNA 都具有物種特異性，所以針對(duì)人類(lèi)基因設(shè)計(jì)的 siRNA 沉默其他物種的同源序列的效果無(wú)法保證。如果希望 siRNA 能對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上的物種有效，這需要進(jìn)行相應(yīng)的生物信息學(xué)分析。

▐ 2. 同樣的 siRNA 為什么在細(xì)胞 A 中有效，在細(xì)胞 B 效果不好？
不同細(xì)胞可能轉(zhuǎn)染效率不一樣，基因表達(dá)水平也不一樣，這些都與 siRNA 的作用效率有關(guān)。
▐ 3. 如何設(shè)計(jì)用于 RT-PCR 的引物？
RT-PCR 的引物應(yīng)該設(shè)計(jì)在 siRNA 靶向位點(diǎn)的兩側(cè)，而不是同側(cè)。設(shè)計(jì)于同側(cè)的 PCR 引物可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
另外，RT-PCR 結(jié)果會(huì)因?yàn)榘谢��?mRNA 降解時(shí)間不同、細(xì)胞內(nèi)靶基因 mRNA 豐度不同而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，推薦使用多種檢測(cè)方式包括 RT-PCR、Northern、Western 檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證 siRNA 的效果。
▐ 4. 如何改善基因沉默的效果？

• 提高轉(zhuǎn)染效率：首先可依據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染條件 (細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)染試劑用量，轉(zhuǎn)染時(shí)間等) 優(yōu)化嘗試，其次可嘗試在其他細(xì)胞類(lèi)型上進(jìn)行轉(zhuǎn)染。若由于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖拗茻o(wú)法使用其他細(xì)胞，可考慮更換轉(zhuǎn)染試劑或轉(zhuǎn)染方法 (如電轉(zhuǎn))。
• 轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用無(wú)血清培養(yǎng)基：血清會(huì)阻礙轉(zhuǎn)染試劑與 siRNA 形成復(fù)合物，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)染效果。
• 優(yōu)化 siRNA 濃度：siRNA 最佳工作濃度因不同的細(xì)胞類(lèi)型及研究目的而異，這取決于 siRNA，細(xì)胞系和選擇的分析方法。推薦 siRNA 工作濃度為 50 nM，也可以使用不同的濃度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效率。但過(guò)高濃度的 siRNA 可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
• 調(diào)整細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。
• 重新設(shè)計(jì) siRNA：若確定轉(zhuǎn)染效果尚佳，其他因素也分析沒(méi)有問(wèn)題的情況下，卻沒(méi)有達(dá)到理想的基因沉默效果，則可以嘗試重新設(shè)計(jì)其他 siRNA。

▐ 5. 為什么轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡？
可能原因有：

• 轉(zhuǎn)染試劑濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
• 轉(zhuǎn)染時(shí)的培養(yǎng)基中加入了抗生素，這會(huì)降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
• 細(xì)胞本身狀態(tài)不佳。

▐ 6. 為什么檢測(cè)發(fā)現(xiàn)靶基因的 mRNA 水平下降了但蛋白水平?jīng)]有下降？
一般情況下，靶基因 mRNA 的降解直接導(dǎo)致靶基因蛋白表達(dá)下降。但是一些情況下也可能出現(xiàn) mRNA 下降水平但蛋白下降水平并沒(méi)有下降。
可能原因有：

• 真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位置不同�？赡� mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的變化上或者未達(dá)到足以檢測(cè)的水平。所以一般建議蛋白檢測(cè)的時(shí)間要稍稍推后。
• 某些蛋白表達(dá)量到一定的程度之后，足以滿足細(xì)胞功能。轉(zhuǎn)錄出來(lái)的部分 mRNA 被降解，并沒(méi)有參與蛋白翻譯的過(guò)程。因此，mRNA 水平的下降可能沒(méi)有引起蛋白水平下降。
• 某些基因有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，而且有可能每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都會(huì)編碼產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白。而設(shè)計(jì)的 siRNA 只是針對(duì)其中一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其他的轉(zhuǎn)錄本并未受影響，仍正常表達(dá)蛋白。
• 可能涉及到其他更加復(fù)雜的機(jī)制。

▐ 7. MCE 的預(yù)設(shè)計(jì) siRNA 套裝可以用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嗎？

• 動(dòng)物的體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì) siRNA 產(chǎn)品的穩(wěn)定性提出了更高的要求。所以一般用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的 siRNA 需要做化學(xué)修飾。
• MCE 的套裝中的 siRNA 沒(méi)有做過(guò)化學(xué)修飾，不適合用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。MCE 可以提供不同化學(xué)修飾的 siRNA 的定制服務(wù)。建議客戶選擇已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)效果的 siRNA 序列進(jìn)行化學(xué)修飾，再用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

 

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SPP1 Human Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 SPP1 (Human) 基因。

Sucnr1 Mouse Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Sucnr1 (Mouse) 基因。

Bdnf Mouse Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Bdnf (Mouse) 基因。

Fdx1 Rat Pre-designed siRNA Set A 用于沉默 Fdx1 (Rat) 基因。

siRNA/miRNA Transfection Reagent 一種陽(yáng)離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于 siRNA 和 miRNA 的轉(zhuǎn)染。

參考文獻(xiàn)：
[1] The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2024. Tue. 2 Jul 2024.  

[2] Zhu KY, et al. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 2020;65:293-311. 
[3] Elbashir, et al. (2001) Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888.
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