成年人每天有超過 500 億個(gè)細(xì)胞發(fā)生凋亡，以維持免疫穩(wěn)態(tài)。What？500 億？淡定，成年人體內(nèi)約有 28 萬億個(gè) (女性) - 36 萬億個(gè) (男性) 個(gè)細(xì)胞。這就相當(dāng)于你一天賺 1w，成本 500 哈哈哈。不過話說回來，這 500 億的細(xì)胞凋亡之后，就“全劇終”了么？
 

細(xì)胞凋亡 (Apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡，一種為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。往期小 M 已為大家介紹過細(xì)胞凋亡及其檢測(cè)。

細(xì)胞凋亡過程中，可釋放一類特殊的細(xì)胞外囊泡，稱之為凋亡囊泡 (Apoptotic vesicles, apoVs)，其具有良好的免疫調(diào)節(jié)和促再生作用，而凋亡缺陷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性疾病 (如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)、衰老和腫瘤等。


 Tips: ApoV 從其親代細(xì)胞繼承了多種成分，包括 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，這些成分可以調(diào)節(jié)受體器官和組織。

研究表明，細(xì)胞凋亡缺陷和 H₂S 缺陷均可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫紊亂，那么細(xì)胞凋亡過程是否與內(nèi)源性 H₂S 的產(chǎn)生有關(guān)呢？哎嘿，好巧不巧 ，凋亡產(chǎn)氣！

近期，施松濤/陳暢團(tuán)隊(duì)在 Cell 子刊 Cell Metabolism 上發(fā)表了題為：Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation 的研究論文[1]。

圖 1. 細(xì)胞凋亡釋放 H₂S 氣體抑制 Th17 細(xì)胞分化^[1]。

該研究探討了凋亡、硫化氫 (H₂S)、以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus,SLE) 之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡是機(jī)體 H₂S 的重要來源，且凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡囊泡 (apoV) 可繼承 H₂S 生成能力，揭示了細(xì)胞凋亡在維持 H₂S 穩(wěn)態(tài)中的相關(guān)機(jī)制，讓我們一起來瞅瞅到底是個(gè)啥子情況？

目前，凋亡缺陷的 MRL/lpr (B6.MRL-Faslpr/J) and Bim−/− (B6.129S1-Bcl2l11tm1.1Ast/J) 小鼠已被廣泛用于 SLE 疾病模型。

研究團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)其 H₂S 水平，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡缺陷的 MRL/lpr 和 Bim−/− 小鼠中的 H₂S 水平顯著降低。主要表現(xiàn)為：與野生型 (WT) 組相比，MRL/lpr 和 Bim−/− 小鼠的血液及肝臟、肺、脾和腎中的 H₂S 水平顯著降低 (圖 2 A-B)。與 WT 小鼠相比，來自 MRL/lpr  和 Bim−/− 小鼠的 PBMC 顯示出細(xì)胞凋亡率降低和 H₂S 水平降低 (圖 2C)。

圖 2. 凋亡缺陷小鼠 H₂S 水平降低^[1]。

(A) 醋酸鉛形成試驗(yàn)顯示雌性 MRL/lpr 和 Bim^−/− 小鼠血液 H₂S 濃度降低; (B) 醋酸鉛形成實(shí)驗(yàn)顯示，凋亡缺陷小鼠肝中 H₂S 濃度低于 WT 小鼠 (肺、脾、腎未顯示); (C) 來自雌性 MRL/lpr 和 Bim^−/− 小鼠的 PBMC 顯示凋亡細(xì)胞和 H₂S 水平降低。黃色箭頭表示 H₂S，白色箭頭表示凋亡細(xì)胞; (D) STS 處理提高了 MRL/lpr 小鼠的血液 H₂S 濃度，而 Z-VAD 處理降低了 H2 濃度; (E) STS 治療增加了MRL/lpr 小鼠肝臟中的 H₂S 濃度 (肺、脾、腎未顯示)，而 Z-VAD 治療則抑制了該濃度; (F) STS 處理促進(jìn) MRL/lpr 小鼠 PBMC 中的細(xì)胞凋亡和 H₂S 生成，Z-VAD可減輕這種情況。黃色箭頭表示 H₂S，白色箭頭表示凋亡細(xì)胞。

同時(shí)，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)可以提高 MRL/lpr 小鼠中 H₂S 的水平，通過使用 Staurosporine (STS，用于誘導(dǎo) MRL/lpr 小鼠體內(nèi)細(xì)胞凋亡) 和 Z-VAD (OMe)-FMK（Z-VAD，一種泛半胱天冬酶抑制劑，用于抑制 STS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡）發(fā)現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)可以挽救 MRL/lpr 小鼠中降低的 H₂S 水平 (圖 2D-F)。

更重要的是，凋亡細(xì)胞能夠產(chǎn)生 H₂S。研究人員以小鼠骨髓干細(xì)胞 (mBMSCs)、PBMCs 和 CD4+ T 細(xì)胞為樣本，STS 和 UV 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以提高細(xì)胞上清液中 H₂S 水平 (圖 3)。

圖 3. 凋亡細(xì)胞體外釋放 H₂S^[1]。

凋亡誘導(dǎo) (STS 和 UV 處理) 后，使用醋酸鉛形成測(cè)試評(píng)估不同細(xì)胞上清液中的 H₂S 濃度。結(jié)果表明，STS 和 UV 處理顯著增加了 mBMSCs、PBMCs 和 CD4⁺ T 細(xì)胞中的 H₂S 濃度，而添加 Z-VAD 則降低了 H₂S 濃度。
 

此外，以 STS 誘導(dǎo)的 mBMSCs 凋亡為模型，發(fā)現(xiàn)凋亡的 mBMSCs 主要在凋亡的早期和中期產(chǎn)生 H₂S。

研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 H₂S 有利于維持免疫穩(wěn)態(tài)。一方面，細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)可通過提高 MRL/lpr 小鼠中的 H₂S 水平來改善 SLE 表型。另一方面，凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的 H₂S 抑制 MRL/lpr 小鼠中異常的 Th17 細(xì)胞分化。

流式細(xì)胞術(shù)分析表明，用 H₂S 供體 NaHS 處理直接抑制體外 Th17 細(xì)胞分化，而 Hydroxylamine hydrochloride (HA，H₂S 合成抑制劑) 處理則促進(jìn) Th17 細(xì)胞分化 (圖 4A)。兩種治療均顯示出劑量依賴性效應(yīng)。且在體內(nèi) MRL/lpr 小鼠中，NaHS 處理降低了脾臟和血液中 Th17 細(xì)胞的水平，而 HA 處理增強(qiáng)了 Th17 細(xì)胞的分化。

圖 4. 流式細(xì)胞儀分析 NaHS 和 HA 處理下的 Th17 細(xì)胞分化率^[1]。

▐  H₂S 通過 Sep15/STAT1/STAT3 軸抑制 Th17 細(xì)胞分化
通過探索 H₂S 調(diào)節(jié) Th17 細(xì)胞分化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn) H₂S 通過 Sep15/STAT1/STAT3 軸抑制 Th17 細(xì)胞分化。

 

 Tips: H₂S 主要通過蛋白質(zhì)硫化作用 (SHY) 發(fā)揮生物學(xué)功能和分子調(diào)節(jié)作用。SHY 是一種翻譯后修飾，是一種生理過程，其中 H₂S 在半胱氨酸的硫醇 (-SH) 基團(tuán)上添加額外的硫，產(chǎn)生氫過硫化物 (-SSH)。

在 STAT 家族中，磷酸化是核定位和隨后的生物活性的必要先決條件。在 Th17 細(xì)胞分化過程中，H₂S 可以促進(jìn) STAT1 磷酸化并抑制 STAT3 磷酸化，免疫沉淀-質(zhì)譜 (IP-MS) 和 coIP 測(cè)定證實(shí) Sep15 可以與 STAT1 結(jié)合。且 H₂S 硫水合物 Sep15 在 C38 位點(diǎn)與 Sep15 結(jié)合并促進(jìn) Sep15 和 STAT1 之間的相互作用，從而促進(jìn) STAT1 的磷酸化和核定位。

圖 5. H₂S 通過 Sep15/STAT1/STAT3 信號(hào)軸抑制 Th17 細(xì)胞分化^[1]。

(A) 當(dāng) STAT1 被 siRNA 敲低時(shí)，H₂S 未能抑制 Th17 細(xì)胞中的 p-STAT3 表達(dá)。(B) STAT1 的敲低削弱了 H₂S 對(duì) Th17 細(xì)胞的抑制作用。(C) H₂S 抑制 Th17 細(xì)胞分化作用中 Sep15/STAT1/STAT3 軸示意圖。 
 

此外，通過小干擾 RNA (siRNA) 敲低 STAT1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) H₂S 抑制 STAT3 的磷酸化，但該作用被 STAT1 的敲低所抑制 (圖 5A)。當(dāng) STAT1 表達(dá)被敲低時(shí)，H₂S 對(duì) Th17 細(xì)胞分化和相關(guān)基因表達(dá)的抑制作用也受損 (圖 5B)，這表明 H₂S 的抑制作用與 Sep15/STAT1/ STAT3 軸密切相關(guān) (圖 5C)。

ApoV 是凋亡細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功能。在哺乳動(dòng)物中，H₂ 由 L-半胱氨酸通過三種酶合成，即胱硫醚 β-合酶 (cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶 (3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)。

研究發(fā)現(xiàn)凋亡的 mBMSC (apoMSC) 和 apoV 表達(dá) CBS、CSE 和 3-MST（圖 6A-B)。微電極測(cè)定顯示 apoVs 可以產(chǎn)生 H₂S，而 HA 或 Propargylglycine (PAG, CSE 抑制劑) 處理抑制 apoVs 產(chǎn)生的 H₂S 濃度（圖 6C)。也就是說，apoV 具有產(chǎn)生 H₂S 的能力。

圖 6. H₂S 是 apoV 介導(dǎo)的 SLE 治療所必需的^[1]。

(A) 通過蛋白質(zhì)印跡評(píng)估 mBMSC、凋亡 mBMSC (apoMSC) 和 apoV 中 CBS、CSE 和 3-MST 的表達(dá)。(B) 通過免疫熒光法評(píng)估 apoV 中 CBS、CSE 和 3-MST 的表達(dá)。(C) H₂S 微電極顯示 apoVs 產(chǎn)生 H₂S，HA 和 PAG 處理抑制 H₂S。(D-E) ApoV 抑制 IgG 在脾臟和皮膚中的沉積；箭頭表示 IgG 沉積。(比例尺：腎臟為 20 μm，皮膚為 100 μm），而 CBS^−/− apoV 和 CSE^−/− apoV 的功能受損。

此外，凋亡細(xì)胞中的 H₂S 改善小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡表型。通過收集 apoVs 并全身輸注到 MRL/lpr 小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明，apoV 減輕了 MRL/lpr 小鼠的 SLE 表型，減輕了脾臟和淋巴結(jié)的重量，降低血清 ANA、BUN 和 dsDNA 水平，緩解腎臟損傷；并抑制腎臟和皮膚中的 IgG 沉積（圖 6D-E)。然而，CBS−/− apoV 和 CSE−/− apoV （CBS−/− 和 CSE−/−小鼠，H₂S 缺陷小鼠，表現(xiàn)出 SLE 樣表型) 均未能在 MRL/lpr 小鼠中發(fā)揮這種治療作用（圖 6D-E)。這些數(shù)據(jù)表明 apoV 可以產(chǎn)生 H₂S，這是 SLE 小鼠的治療效果所必需的。

由此可見，細(xì)胞凋亡并非“壞事”，細(xì)胞凋亡后也并不是最終的結(jié)局，其釋放的 H₂S 氣體可以抑制 Th17 細(xì)胞分化，維持免疫穩(wěn)態(tài)。同時(shí)，凋亡細(xì)胞中的 H₂S 可改善小鼠系統(tǒng)性紅斑狼瘡表型。

 

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Staurosporine 凋亡誘導(dǎo)劑, Staurosporine 也是一種有效，ATP 競(jìng)爭(zhēng)性的，非選擇性蛋白激酶抑制劑，抑制 PKC，PKA，c-Fgr，和 Phosphorylase kinase 的 IC50 分別為 6 nM，15 nM，2 nM，3 nM。Staurosporine 也抑制 TAOK2，IC50 值 3 μM。

Z-VAD(OMe)-FMK 一種不可逆的 pan-caspase 抑制劑。Z-VAD(OMe)-FMK 是泛素 C 末端水解酶 L1 (UCHL1) 抑制劑。Z-VAD(OMe)-FMK 通過靶向 UCHL1 活性位點(diǎn)對(duì) UCHL1 進(jìn)行不可逆地修飾。

Hydroxylamine hydrochloride 一種選擇性單胺氧化酶 (MAO) 抑制劑，可用于抑制血小板聚集。Hydroxylamine hydrochloride 是有機(jī)合成的中間體。

Bafetinib 一種具有口服活性的 Lyn/Bcr-Abl 酪氨酸激酶抑制劑。Bafetinib 通過 Bcl-2 家族調(diào)節(jié)的內(nèi)在凋亡途徑增強(qiáng)幾種促凋亡的 Bcl-2 同源性 (BH) 3-純蛋白 (Bim、Bad、Bmf 和 Bik) 的活性，并誘導(dǎo) Ph+ 白血病細(xì)胞凋亡。Bafetinib 具有抗腫瘤活性。

‍WEHI-9625‍ 一種首創(chuàng)的，三環(huán)砜小分子凋亡抑制劑，EC50 值為 69 nM。WEHI-9625 與 VDAC2 結(jié)合可促進(jìn)其抑制小鼠 BAK 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力，但對(duì)人 BAK 和與凋亡效應(yīng)密切相關(guān)的 BAX 因子均完全無效。

 

參看文獻(xiàn)：
[1] Ou Q, et al. Apoptosis releases hydrogen sulfide to inhibit Th17 cell differentiation. Cell Metab. 2024 Jan 2;36(1):78-89.e5.