腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境中一種可塑性異質(zhì)細胞群體，占某些實體腫瘤的50%，TAMs通常表現(xiàn)出免疫抑制M2表型，導致預后不良。TAMs通過刺激血管生成，增加腫瘤細胞的遷移和侵襲，抑制抗腫瘤免疫引起惡性發(fā)展。由于TAMs的高度可塑性，將抗炎巨噬細胞極化為促炎巨噬細胞是一種很有前途的抗腫瘤方法。目前常用的策略是通過局部或全身給藥來輸送外源性物質(zhì)，如免疫因子、單抗和免疫激動劑。然而，在不影響正常凝血的情況下，精確誘導腫瘤出血的新材料仍面臨挑戰(zhàn)。

近日，南京大學吳錦慧教授團隊在 ADVANCED MATERIALS（IF=29.4）上發(fā)表了題為“Flagella of Tumor-targeting Bacteria Trigger Local Hemorrhage to Reprogram Tumor-associated Macrophages for Improved Antitumor Therapy”的研究論文。他們通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種腫瘤靶向多鞭毛細菌(flhDC VNP)，從而實現(xiàn)了精確的腫瘤出血。flhDC VNP在腫瘤中定植，并在增殖過程中過度表達鞭毛。鞭毛促進腫瘤壞死因子TNFα 的表達，從而導致局部腫瘤出血。出血時滲入的紅細胞使巨噬細胞暫時極化為M1亞型。在青蒿琥酯(artesunate，Arts)存在下，其與血紅素(heme)形成一種絡合物，不斷產(chǎn)生活性氧(ROS)使暫時的極化轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)的極化。因此，腫瘤靶向細菌鞭毛可能為重新編程TAMs和改進抗腫瘤治療開辟新的策略。

圖1  觸發(fā)局部出血和TAM重新編程的腫瘤靶向細菌的鞭毛示意圖

FlhDC VNP和∆flhD VNP的構(gòu)建及鑒定
 

研究團隊首先在減毒沙門氏菌VNP20009(Vnp)中引入高表達鞭毛主調(diào)蛋白flhDC質(zhì)粒，構(gòu)建flhDC VNP細菌。通過阿拉伯糖(abs816776)的誘導，flhDC VNP成功表達由超表達質(zhì)粒編碼的熒光蛋白tdTOMATO、鞭毛和flhDC蛋白。為了研究鞭毛是否可以穩(wěn)定過表達，他們連續(xù)傳代了持續(xù)表達flhDC蛋白的flhDC VNP，表明flhDC VNP的鞭毛過表達相對穩(wěn)定。掃描電子顯微鏡觀察，表明 flhDC VNP鞭毛的數(shù)量遠遠高于未經(jīng)編輯的VNP。通過敲除細菌基因組中的flhD基因構(gòu)建鞭毛缺陷沙門氏菌ΔflhD VNP，掃描電子顯微鏡觀察表明ΔflhD VNP表面無鞭毛。為了研究鞭毛的數(shù)量對細菌的運動是否是必要的，研究者進行了瓊脂封閉式Transwell試驗。flhDC VNP能在2 h內(nèi)迅速穿透瓊脂，而VNP和ΔflhD VNP幾乎不能穿透瓊脂。在3D細胞組織中的進一步實驗表明，flhDC VNP穿透更深。因此，這些結(jié)果表明，他們成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達的flhDC VNP和ΔflhD VNP，且細菌的運動能力隨著鞭毛數(shù)量的增加而增強。

圖2  多鞭毛細菌的構(gòu)建與表征

FlhDC VNP誘導腫瘤出血

為了研究鞭毛數(shù)量的增加是否會增加細菌在腫瘤中的積累，研究人員將等量的VNP，flhDC VNP和ΔflhD VNP靜脈注入荷瘤小鼠體內(nèi)，在不同時間取小鼠主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）進行細菌計數(shù)，結(jié)果所有細菌在腫瘤中的積聚隨著時間的推移而增加。此外，在注射細菌72小時后，flhDC VNP在腫瘤中的積聚量是VNP和ΔflhD VNP的10倍。這些數(shù)據(jù)表明，鞭毛數(shù)量的增加有利于腫瘤內(nèi)細菌的增殖。在其他器官中，由于免疫細胞的清除作用，細菌的分布呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。

為了探究鞭毛數(shù)量的增加是否可以增加血液中炎性細胞因子的分泌，他們比較了靜脈注射flhDC VNP、ΔflhD VNP和VNP后腫瘤壞死因子TNFα 的濃度隨時間的變化。結(jié)果表明，注射后1h血液中TNFα 濃度最高，并且flhDC VNP刺激TNFα 分泌的作用明顯高于ΔflhD VNP和VNP。由于腫瘤血管的低流速和高通透性，過量的炎癥因子可能會破壞腫瘤血管。隨著時間的推移，腫瘤出血加重，在注射細菌12h時，腫瘤內(nèi)的紅細胞浸潤量達到最大。注射細菌后12h取材，蘇木精伊紅(H&E)染色。注射flhDC VNP的腫瘤含有最多的浸潤性紅細胞。這些數(shù)據(jù)表明，flhDC VNP在腫瘤內(nèi)積聚，通過增加炎性細胞因子水平而導致腫瘤出血。

圖3  細菌誘導TNFα 分泌增加并且誘導腫瘤出血

Heme與Arts反應形成能極化巨噬細胞的復合體

正常情況下，滲透的紅細胞被巨噬細胞吞噬。在巨噬細胞內(nèi)，紅細胞分解為血紅蛋白，血紅蛋白被消化為血紅素。然后，血紅素通過HRG1從內(nèi)體運輸?shù)骄奘杉毎�胞漿。血紅素能與含有過氧化鍵的抗瘧疾藥物發(fā)生特異性反應，如Arts。當Arts被低價過渡金屬絡合物（血紅素）激活時，弱過氧化鍵發(fā)生均質(zhì)斷裂產(chǎn)生ROS。研究人員發(fā)現(xiàn)，血紅素和Arts結(jié)合產(chǎn)生了一種具有過氧化物酶活性的復合物。過氧化物酶可以催化過氧化氫產(chǎn)生羥基自由基，同樣也可以增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

ROS水平升高會影響巨噬細胞的表型。ROS通過MAPK信號通路、NF-kB信號通路、NOD樣受體和改變線粒體膜電位促進促炎巨噬細胞極化。研究結(jié)果表明，Arts-血紅素復合體顯著增加巨噬細胞的促炎表型。促炎調(diào)節(jié)是通過改變線粒體膜電位來調(diào)節(jié)的。因此，紅細胞與Arts形成復合體，通過改變線粒體膜電位和激活NLRP3炎性小體，增加巨噬細胞內(nèi)ROS水平，極化TAMs。

圖4  血紅素heme與青蒿琥酯Arts反應產(chǎn)生ROS持續(xù)極化巨噬細胞

FlhDC VNP與Arts聯(lián)合應用極化巨噬細胞并促進腫瘤炎癥微環(huán)境

由于巨噬細胞在腫瘤中的占比高達50%，并且具有高度可塑性，因此研究團隊進一步研究flhDC VNP和Arts聯(lián)合給藥后TAMs的表型變化。結(jié)果顯示，flhDC VNP聯(lián)合Arts顯著增加了促炎TAMs的比例，降低抗炎TAMs的比例。巨噬細胞的促炎極化可能改變腫瘤的免疫微環(huán)境。對腫瘤的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，flhDC VNP和Arts可以上調(diào)多個炎癥相關(guān)基因以及多種炎癥信號通路、細胞趨化因子通路和免疫系統(tǒng)過程通路，如TNF信號通路、NF-κB信號通路和趨化因子信號通路。因此，flhDC VNP和Arts聯(lián)合應用可使TAMs極化為促炎表型，增加腫瘤免疫細胞的浸潤，從而使腫瘤免疫微環(huán)境從“冷瘤”轉(zhuǎn)變?yōu)?/strong>“熱瘤”。