摘要

微波增強(qiáng)的多肽固相合成（SPPS）可以合成具有對(duì)稱(chēng)賴(lài)氨酸分支的多抗原肽（MAPs）或多肽樹(shù)枝狀大分子，合成時(shí)間大幅降低，純度提高。四分支�；�載體蛋白（ACP）肽的合成在2小時(shí)內(nèi)完成，純度為70%。四分支M10肽¹（巴西副球孢子菌糖蛋白T細(xì)胞表位）的合成在4小時(shí)內(nèi)完成，純度為50%。在2小時(shí)內(nèi)合成純度為80%的一個(gè)八聚體，第三代賴(lài)氨酸-亮氨酸抗菌肽樹(shù)枝狀大分子（G3KL）²。

 

引言

對(duì)稱(chēng)分支肽（圖1）代表一類(lèi)具有非常理想的理化和生物學(xué)特性的肽。在一些情況下，由于與蛋白質(zhì)靶標(biāo)的多價(jià)結(jié)合或具有更高的蛋白酶抗性，包含分支核心的肽，如多抗原肽（MAPs）或肽樹(shù)狀聚合物有更高的生物活性³。因此分支肽已被用于各種治療應(yīng)用，包括開(kāi)發(fā)抗微生物和抗病毒藥物^4,5、腫瘤靶向劑^6,7和藥物輸送載體⁸。

圖1:左：對(duì)稱(chēng)分支的賴(lài)氨酸核心；

右：Fmoc-Lys(Fmoc)-OH

對(duì)稱(chēng)分支肽的合成可通過(guò)在SPPS中使用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH來(lái)生成支鏈位置。合成通常比較困難，因?yàn)樵诜种еЪ苌想逆湽逃械木o密接近性，會(huì)導(dǎo)致空間沖突和肽偶聯(lián)不良。將微波能量應(yīng)用于分支肽的合成克服了這些空間挑戰(zhàn)，允許更有效的偶聯(lián)和快速合成較少缺失的困難分支肽產(chǎn)物 (CarboMAXTM)。⁹

 

材料和方法

試劑

以下含有特定側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的Fmoc氨基酸購(gòu)自CEM公司(Matthews, NC)：Arg(Pbf)、Asn (Trt)、Asp (OtBu)、Gln(Trt)、His (Boc)、Lys (Boc)、Tyr (tBu) 和Thr (tBu)。Rink Amide ProTide LL 樹(shù)脂也得自CEM 公司。Fmoc-6-Ahx-OH 購(gòu)自AnaSpec (Fremont, CA)。Fmoc-Lys(Fmoc)OH 獲自 CreoSalus (Louisville, KY)。N,N'二異丙基碳二亞胺(DIC)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、3,6-二氧六環(huán)-1,8-辛二硫醇(DODT) 和三異丙基硅烷(TIS) 購(gòu)自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無(wú)水乙醚(Et2O)、乙酸、HPLC 級(jí)水和乙腈購(gòu)自VWR (West Chester, PA)。LC-MS 級(jí)水(H2O) 和LC-MS 級(jí) 乙 腈 (MeCN) 購(gòu) 自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

 

多肽合成：四分支ACP, (VQAAIDYING)4-(K)2-K-Ahx-KK-NH2

使用CEM Liberty BlueTM 自動(dòng)微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL 樹(shù)脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.1 mmol 規(guī)模（樹(shù)脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進(jìn)行脫保護(hù)。在 DMF (CarboMAX) ⁹中，五倍過(guò)量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/ TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。切割后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

Tetra-branched ACP

多肽合成: 四分支M10, (LIAIHTLAIRYAN)4-(K)2-K-Ahx-KK- NH2

使 用 CEM Liberty BlueTM 自 動(dòng) 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹(shù) 脂（離 子 交 換 容 量 ：0.19 meq/g）上 以 0.1 mmol 規(guī)模（樹(shù)脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和 Oxyma Pure 在DMF 中進(jìn)行脫保護(hù)。在 DMF 中 5 倍過(guò)量的Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)( CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用帶有 TFA/H2O/TIS/DODT 的CEM RazorTM 高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并過(guò)夜凍干。

Tetra-branched M10

多肽合成：G3KL 八聚體, (KL)8-(KKL)4-(KKL)2-KKL-Ah-KK-NH2

使 用 CEM Liberty Blue 自 動(dòng) 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹(shù)脂（離子交換容量：0.19 meq/g）上以0.25 mmol 規(guī)模（樹(shù)脂規(guī)模：0.025 mmol）制備肽（下圖）。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF 中進(jìn)行脫保護(hù)。在 DMF 中5倍過(guò)量的 Fmoc-AA 與DIC 和Oxyma Pure 進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)(CarboMAX)⁹。Fmoc-Lys(Fmoc)-OH 用于分支位置的K。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)進(jìn)行切割。裂解后，用無(wú)水乙醚沉淀肽并凍干過(guò)夜。

G3KL Octamer

多肽分析

在配備有 PDA 檢測(cè)器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上分析肽，該 檢 測(cè) 器 配 備 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7mm 和2.1×100mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到Waters 3100 Single Quad MS 用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。在 Waters MassLynx 軟件上進(jìn)行峰值分析。在 (i)H2O 和 (ii)MeCN 中以0.05% TFA的梯度洗脫進(jìn)行分離。

 

結(jié)果

Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上的使用微波增強(qiáng) SPPS 合成四分支的ACP多肽，產(chǎn)生了 70% 純度的目標(biāo)肽（圖2）。

圖2：四分支ACP的UPLC色譜圖

Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng) SPPS 合成在Liberty Blue 自動(dòng)微波肽合成儀上使用微波增強(qiáng) SPPS 合成 G3KL 八聚體產(chǎn)生了 80% 純度的目標(biāo)肽（圖4）。

 

圖3：四分支M10的UPLC色譜圖

圖4 ：G3KL八聚體的UPLC色譜圖

 

結(jié)論

與傳統(tǒng)的 SPPS 方法相比，使用微波增強(qiáng)的 SPPS 可以更快地制備對(duì)稱(chēng)分支肽，并且純度更高。使用微波增強(qiáng) SPPS，在2小時(shí)內(nèi)合成了純度為 70% 的四分支 ACP。四支化 M10 肽的常規(guī)室溫合成需要超過(guò)42小時(shí)的手工勞動(dòng)，目標(biāo)肽的分離產(chǎn)率為 4%。

另一方面，微波增強(qiáng)的 SPPS 可在4小時(shí)內(nèi)提供純度為50%。G3KL 八聚體的常規(guī)合成需要超過(guò)35小時(shí)的手工勞動(dòng)時(shí)間，并以 8% 的分離產(chǎn)率產(chǎn)生目標(biāo)肽。² 將微波能量應(yīng)用于 G3KL 八聚體的合成可在2小時(shí)內(nèi)以 80% 的純度提供目標(biāo)肽 。

 

參考文獻(xiàn)

[1] Taborda, C. P.; Nakaie, C. R.; Cilli, E. M.; Rodrigues,E.G.;Silva, L. S.; Franco, M. F.; Travassos, L. R. Scand. J. Immunol. 2004, 59 (1), 58–65.

[2] Stach, M.; Siriwardena, T. N.; Köhler, T.; van Delden, C.; Darbre, T.; Reymond, J.-L. Angew. Chemie Int. Ed. 2014, 53 (47), 12827–12831.

[3] Falciani, C.; Lozzi, L.; Pini, A.; Corti, F.; Fabbrini, M.; Bernini, A.; Lelli, B.; Niccolai, N.; Bracci, L. Chem. Biol. Drug Des. 2007, 69 (3), 216–221.

[4] Liu, S. P.; Zhou, L.; Lakshminarayanan, R.; Beuerman, R. W. Int. J. Pept. Res. Ther. 2010, 16 (3), 199–213.

[5] Wynn, J. E.; Santos, W. L. Org. Biomol. Chem. 2015, 13 (21), 5848–5858.

[6] Falciani, C.; Pini, A.; Bracci, L. Expert Opin. Biol. Ther. 2009, 9 (2), 171–178.

[7] Minervini, A.; Siena, G.; Falciani, C.; Carini, M.; Bracci, L. Expert Rev. Anticancer Ther. 2012, 12 (6), 699–701.

[8] Brunetti, J.; Pillozzi, S.; Falciani, C.; Depau, L.; Tenori, E.; Scali, S.; Lozzi, L.; Pini, A.; Arcangeli, A.; Menichetti, S.; Bracci, L. Sci. Rep. 2015, 5, 17736.