摘要
在藥物研發(fā)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)、肽和寡核苷酸等生物聚合物的界限正在逐漸模糊。因此，通過(guò)靈活的合成平臺(tái)快速獲取這些分子對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性藥物開(kāi)發(fā)至關(guān)重要。

本應(yīng)用重點(diǎn)介紹了在 PurePep^® Chorus 儀器上成功合成短寡核苷酸（18-24 個(gè)堿基）序列，展示了其在肽合成之外的多功能性。

簡(jiǎn)介
現(xiàn)代藥物研發(fā)融合了多種新藥物類型，例如寡核苷酸序列、RNA、靶向蛋白質(zhì)降解劑以及下一代多肽（例如“超越 5 規(guī)則”的環(huán)肽）。¹為了保持針對(duì)特定靶標(biāo)的潛在藥物的研發(fā)競(jìng)爭(zhēng)力，快速靈活地獲取這些分子至關(guān)重要。

合成寡核苷酸在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的作用日益突出。從基因調(diào)控研究到腫瘤診斷、治療和疫苗研發(fā)，寡核苷酸在我們的日常生活中變得越來(lái)越重要。²

Gyros Protein Technologies以其在全自動(dòng)固相多肽合成儀領(lǐng)域的長(zhǎng)期卓越表現(xiàn)而聞名。這些儀器的核心是 PurePep Pathway技術(shù)，這是一種流路閥塊系統(tǒng)，可在惰性氣體環(huán)境下將液體從溶劑/試劑瓶移動(dòng)到反應(yīng)容器中。由于寡核苷酸合成也需要惰性環(huán)境條件，我們著手使用模塊化 PurePep Chorus 合成儀將化學(xué)合成范圍從肽擴(kuò)展到寡核苷酸。

本應(yīng)用說(shuō)明將展示如何實(shí)現(xiàn)短寡核苷酸引物的全自動(dòng)合成，包括11 個(gè) 18-mer至  24-mer引物和已知藥物。

方法
寡核苷酸合成循環(huán)
寡核苷酸固相亞磷酰胺化學(xué)合成循環(huán)涉及以下步驟（圖 1）：^3,4
脫保護(hù)：循環(huán)由去除固相載體連接核苷的 5’-DMT(4,4’-dimethoxytrityl)保護(hù)基開(kāi)始。

• 循環(huán)步驟 1：偶聯(lián)

  一旦 DMT 被去除，固相載體連接核苷的游離 5’-OH 基團(tuán)就能夠與下一個(gè)作為亞磷酰胺單體添加的核苷發(fā)生反應(yīng)。Tetrazole或5-(ethylthio)-1H-tetrazole用作偶聯(lián)的催化劑。

• 循環(huán)步驟 2：封端

  一些 5’-OH 基團(tuán)將保持未反應(yīng)狀態(tài)。這些羥基將在下一個(gè)循環(huán)中發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致序列中缺少堿基（缺失序列）。為了防止缺失突變的積累，實(shí)施常規(guī)的封蓋反應(yīng)。
   

圖 1 亞磷酰胺化學(xué)合成方法概述

• 循環(huán)步驟 3：氧化

  氧化反應(yīng)將不穩(wěn)定的亞磷酸三酯轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的磷酸三酯——氧化后的額外封端步驟對(duì)整個(gè)反應(yīng)混合物起到脫水的作用。

• 循環(huán)步驟 4：脫三苯甲基化

  在啟動(dòng)下一個(gè)偶聯(lián)循環(huán)之前，DMT 保護(hù)基團(tuán)被去除.

• 以裂解和脫保護(hù)結(jié)束

  最終，用氨將全長(zhǎng)寡核苷酸從固相中裂解下來(lái)，并進(jìn)行熱處理以去除雜環(huán)堿基和磷酸二酯。

表 1 本研究期間合成的寡核苷酸。⁵

PurePep Chorus 上的寡核苷酸合成
我們采用 PurePep Chorus 肽合成儀，以 5 μmol 的規(guī)模，使用 Glen Research、Maravai LifeSciences 的可控孔徑玻璃(CPG) 合成載體（Subst. = 0.025 至 0.050 mmol/g），合成了表 1 中所示的不同寡核苷酸。

反應(yīng)細(xì)節(jié)如下：

• 偶聯(lián)（步驟 1）使用 0.5 mL 0.1 Mnucleotide phosphoramidite（ACN 溶液）和 0.5 mL 0.5M 5-ethylthio-H-tetrazole（ACN 溶液）反應(yīng) 2 x 2 分鐘。

• 封端（步驟 2）使用 0.5 mL Ac2O/Lutidine/THF 1:1:8 v/v 混合物和 0.5 mL 20% v/vN-Me--imidazole（THF 溶液）反應(yīng) 2 分鐘（偶聯(lián)后），氧化步驟后反應(yīng) 1 分 10 秒。

• 氧化（步驟 3）使用 含0.1 M iodine 的 THF/pyridine/water 88:10:2 v/v溶液反應(yīng) 2 分鐘。

• 脫三苯甲基化（步驟 4）使用 含3% 三氯乙酸 (TCA) 的二氯甲烷 (DCM) 反應(yīng) 2 x 2 分鐘。

• 裂解用 30% NH4 OH 水溶液和 40% methylamine水溶液的 1:1 v/v 混合物在室溫下反應(yīng) 1 小時(shí)。

• 每個(gè)步驟之間用乙腈 (ACN) 清洗：脫保護(hù)和偶聯(lián)之間洗滌 4 x 15 秒；偶聯(lián)和封端、封端和氧化以及氧化和第二次封端之間洗滌 2 x 15 秒；第二次封端和脫保護(hù)之間洗滌 3 x 20 秒。

• 始終使用儲(chǔ)存在分子篩上的干燥乙腈，并在所有液體轉(zhuǎn)移和 CPG 干燥過(guò)程中使用氬氣，盡量減少暴露在空氣中。

•  使用 0.05M ((N,N-dimethylaminomethylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazole-5-thione (DDTT) 在pyridine/ acetonitrile (3:2)中進(jìn)行硫化 1 分鐘。

純化
所有截短序列均通過(guò)封端乙酰化，且不攜帶疏水性 DMT 保護(hù)基團(tuán)。脫鹽，并使用 Glen-Pak DNA 純化柱 (PN 60-5200-10) 通過(guò)反相固相萃取以 1 µmol 的規(guī)模將截短序列與 DMT 靶序列分離。

分析
將粗寡核苷酸溶液（100 uL 裂解溶液中取 5 uL）稀釋在 165 uL isopropanol (i-PrOH)/ACN/water（7:1:2）混合溶液中，然后在 Shimadzu HPLC （SPD-M20A 光電二極管陣列檢測(cè)器）上進(jìn)行分析（3 uL 注射量）。分離在 C18-PFP、100 Å、3.0 μm、100 x 3.0 mm柱（Mac-Mod ACE Excel C18-PFP）上進(jìn)行，耗時(shí) 15 分鐘，流速為 0.8 mL/min，使用 5-50% B / A 的梯度，其中緩沖液 A 為 0.1 M triethylamine acetate (TEAA) 水溶液（pH 7），緩沖液 B 為純 ACN。在四個(gè)波長(zhǎng)處監(jiān)測(cè)吸光度， 260 nm 檢測(cè)數(shù)據(jù)用于分析報(bào)告。在 ShimadzuLCMS2020 單四極桿 ESI 質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。另外，在 Agena Biosciences 公司使用 MALDI-TOF 質(zhì)譜儀 MassARRAY Analyzer (Agena Biosciences, Inc.) 對(duì)最終產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。
 

圖 2 通用 pBluescript SK 引物合成的 UV260 nm 色譜圖，步驟 1 至 6（粗品、微裂解液）

結(jié)果與討論
寡核苷酸合成證明
在寡核苷酸序列 #1 的合成過(guò)程中，每次延伸至 8-10 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度后，都會(huì)通過(guò) LC/MS 監(jiān)測(cè)增長(zhǎng)的寡核苷酸鏈（圖 2）。

色譜圖表明，通過(guò) PurePep Chorus 合成器上的自動(dòng)寡核苷酸合成，可以有效延長(zhǎng)目標(biāo)序列。

采用 DMT-on 純化的高質(zhì)量寡核苷酸
受到寡核苷酸偶聯(lián)研究初步結(jié)果的鼓舞，我們繼續(xù)合成寡核苷酸 #2。在這個(gè)例子中，我們強(qiáng)調(diào)了如何使用 DMT-on方法輕松去除雜質(zhì)。圖 3 顯示了純化前的粗 DMT-on寡核苷酸（A 和 C）和純化后的 DMT-off寡核苷酸（B 和 D）。雖然從 UV 色譜圖可以看出改進(jìn)，但通過(guò) MS 分析觀察到剩余的截短序列（D）。對(duì)于 #2 也可以觀察到這種現(xiàn)象，其中多個(gè)截短序列隱藏在產(chǎn)品主峰下（圖 4）。
 

圖3 粗Genasense G3139 （DMT on）[A]和脫鹽Genasense 3139 （DMT off）[B]的UV260 nm色譜圖及其分別的MALDI-TOF質(zhì)譜[C]和[D]。

與肽合成一樣，截短序列的形成是一個(gè)主要問(wèn)題，尤其是對(duì)于較長(zhǎng)的序列。每個(gè)偶聯(lián)步驟都會(huì)向樣品中添加一小部分。然而，在寡核苷酸合成中，這種復(fù)雜性更加關(guān)鍵，因?yàn)槟繕?biāo)序列和截短序列具有非常相似的物理化學(xué)性質(zhì)，因此難以用色譜法分離。DMT-on 方法是解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)非常簡(jiǎn)單的方法，但是為了獲得非常高的峰純度，需要采用額外的純化技術(shù)。
 

圖 4 脫鹽通用 pBluescript SK 引物 (DMT 關(guān)閉) 的 UV260 nm 色譜圖 [A] 及其 MALDI-TOF 質(zhì)譜 [B]。

不同寡核苷酸的自動(dòng)合成
寡核苷酸序列 #3 至 #7 在 PurePep Chorus 上自動(dòng)合成，并用 DMT-on 方法純化，純度非常好，如表 1 所示。

修飾寡核苷酸合成
研究表明，硫代磷酸酯有助于緩解體內(nèi)使用寡核苷酸所面臨的主要挑戰(zhàn)，因?yàn)樗�可以降低各種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)核酸酶的活性，并通過(guò)質(zhì)膜將寡核苷酸遞送到細(xì)胞內(nèi)部。⁶在本研究中，我們合成了三種硫代磷酸酯（#7 - #9）。

硫代磷酸酯衍生物合成過(guò)程中使用的硫化過(guò)程（圖 5）已知會(huì)產(chǎn)生立體異構(gòu)體 α-磷原子，通常會(huì)產(chǎn)生非對(duì)映異構(gòu)體。硫代磷酸酯寡核苷酸的這種固有特性使其分析 HPLC 譜圖復(fù)雜化，因?yàn)樗�得非�?duì)映異構(gòu)體的洗脫時(shí)間會(huì)略有變化。在這些情況下，在分析 RP-HPLC 和 IE-HPLC 譜圖中可能會(huì)觀察到分裂或增寬的產(chǎn)物峰。⁷
 

圖 5 磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸間連接

結(jié)論
PurePep^® Chorus 肽合成儀可在惰性條件下成功合成多種短（18-24 個(gè)堿基）寡核苷酸序列。我們還展示了使用相同平臺(tái)合成硫代磷酸酯和其他標(biāo)記和特殊取代的寡核苷酸的方法。

結(jié)果一覽

• 在 PurePep Chorus 上將合成能力從肽擴(kuò)展到寡核苷酸
• 通過(guò) DMT-on 純化有效獲得高質(zhì)量的短寡核苷酸序列
• 在自動(dòng)合成過(guò)程中應(yīng)用硫化反應(yīng)以擴(kuò)大化學(xué)靈活性

參考
[1] M.-J. Blanco et al., ACS Med. Chem. Lett. 2022, 13,1691 - 1698
[2] L. Moumné et al., Pharmaceutics 2022, 14, 260
[3]https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technicaldocuments/technical-article/genomics/pcr/dnaoligonucleotide-synthesis
[4]https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/oligo-synthesis-why-idt-leads-the-oligo-industry
[5] https://www.lslabs.com/resources/universal-primer-list
[6] S.D. Putney et al., PNAS 1981, 78, 7350-735
[7]https://www.sigmaaldrich.com/US/en/technicaldocuments/technical-article/analytical-chemistry/largemolecule-hplc/profile-analysis-of-phosphorothiolatedoligos
 

PurePep Chorus全自動(dòng)高通量多肽合成儀

• 可配置2、4或6個(gè)反應(yīng)容器
• 選配可控感應(yīng)加熱和振蕩混勻
• 選配實(shí)時(shí)紫外線監(jiān)測(cè)
• 內(nèi)置PurePep Pathway流路系統(tǒng)
• Single Shot^TM液體傳輸技術(shù)
• 直觀的操作軟件
• 自動(dòng)原位切肽
• 自動(dòng)多肽純化