qPCR體系優(yōu)化和常見問題解析大全

瀏覽次數(shù)：3818　發(fā)布日期：2022-8-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

前言

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是用于擴增特定DNA片段的分子生物學實驗技術(shù)。實時熒光定量PCR（以下簡稱qPCR）作為第二代PCR技術(shù)，自1996年推出以來，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達分析、病原微生物檢測、動植物育種等許多研究領(lǐng)域，為了獲得最理想的檢測結(jié)果，qPCR從樣本采集、核酸提取、cDNA合成到上機檢測的流程有許多可以優(yōu)化的參數(shù)。

qPCR實驗的工作流程首先需要確定研究的目的，根據(jù)實驗設(shè)計規(guī)劃好實驗分組、重復(fù)次數(shù)等細節(jié)。接下來分為樣本準備和引物探針驗證兩個重要的步驟。樣本準備主要是核酸提取逆轉(zhuǎn)錄等步驟，引物探針需要去測試特異性和效率。接下來需要使用qPCR儀來對樣品中的目的核酸進行擴增qPCR結(jié)束后根據(jù)實驗?zāi)康膶δ康暮怂徇M行相對或者絕對定量。接下來講的qPCR體系優(yōu)化會圍繞著這個流程展開。

1.樣本的采集與處理

首先，提前做好功課，了解樣本的不同分型，或者了解詳細的細胞分群。如果條件允許盡可能覆蓋所有的組織類型或者細胞類型。其次，盡可能增加樣本數(shù)量，也就是生物學重復(fù)，從而更客觀地反映生物變異程度。另外，qPCR實驗也需要有技術(shù)重復(fù)來降低誤差。

采樣是需要嚴格規(guī)劃的過程，比如材料的時效性、珍貴程度等，都要納入考量范圍。樣品要盡量新鮮，取樣盡可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不馬上提取核酸，需要-80°C保存，并盡快處理。

2.核酸的提取和檢測

模板的質(zhì)量直接影響到檢測性能。核酸提取需要有效地將RNA或DNA從其他混合物中分離。RNA樣本中的污染物——基因組DNA、DNA結(jié)合蛋白、酚類化合物或在提取RNA過程中引入的外源雜質(zhì)(如手套中的粉末)——都已被證明會抑制下游實驗，如逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。核酸提取需要使用無菌無酶的試劑耗材，避免RNase或DNase污染，并對內(nèi)源RNAse或DNAse進行有效抑制；多糖多酚樣品要考慮多糖多酚雜質(zhì)的有效去除。低溫保存防止RNA或DNA降解。

降解或不純的RNA會限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量。部分降解的RNA可能不能給出準確的基因表達結(jié)果。對于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細地檢查RNA的濃度和質(zhì)量�？刹捎酶叻直媛虱傊悄z檢測核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測核酸純度和濃度。

3.cDNA合成

RNA 質(zhì)量對 cDNA 合成結(jié)果會產(chǎn)生重要影響。并且RNA 很脆弱，容易降解。為了保證 RNA 的完整性，我們需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的槍頭和離心管，減少操作時間等。在反應(yīng)體系中加入 RNase 抑制劑也能有效防止 RNA 降解。

如何評價樣品中的雜質(zhì)對逆轉(zhuǎn)錄的影響呢？可以梯度稀釋后繪制標準曲線，如果低濃度的樣品點數(shù)值偏大比較明顯，基本可以判定雜質(zhì)影響顯著。

不同廠家的反轉(zhuǎn)錄試劑會有差異，對RNA中的雜質(zhì)耐受程度也不同。逆轉(zhuǎn)錄酶在整個反轉(zhuǎn)錄體系中具有關(guān)鍵性影響。除了活性以外，逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性同樣很重要，在較高溫度下進行逆轉(zhuǎn)錄，能夠減少 RNA 的二級結(jié)構(gòu)，增加逆轉(zhuǎn)錄的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對 RNA 濃度進行測定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會對上樣量有要求，建議 total RNA 上樣量小于 5 μg。超過這個范圍，會使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性 (表達豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄) 而造成定量結(jié)果不準確。

逆轉(zhuǎn)錄出來的cDNA可以直接放在4°C保存，若長期不用，可分裝，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

絕對定量：檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，需要標準品構(gòu)建標準曲線。

標準品可以是純化的基因組DNA、質(zhì)粒DNA或者體外轉(zhuǎn)錄RNA(cDNA)，其作用是生成標準曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系。

標準品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100%，與樣品的性質(zhì)盡可能接近，與樣品相同的擴增條件（PCR體系、耗材、同一次擴增），大于或等于5個梯度稀釋的標準品。

相對定量：在一個樣本中，目的基因相對于內(nèi)參基因的量的變化。

內(nèi)參基因選擇建議篩選不少于三個內(nèi)參基因來歸一化RT-qPCR數(shù)據(jù)。目的是消除外部樣品偏差，例如總RNA含量，RNA穩(wěn)定性，酶效率或樣品裝載量的變化。

對候選的內(nèi)參基因進行qPCR 實驗，得出Ct平均值以及 Ct值的標準偏差，選擇SD最小的基因作為實驗內(nèi)參。可通過geNorm 、 BestKeeper 、 NormFinder、RefGenes 等工具來評估您的內(nèi)參基因。

② 熒光標記方法

染料法：利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來實現(xiàn)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下呈現(xiàn)微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其綠色熒光增強約1000倍。因此其總的熒光強度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關(guān)系可以反映生成的PCR產(chǎn)物的量。

TaqMan熒光探針：是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收; PCR擴增時, Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探針設(shè)計可以參考Gene π網(wǎng)站：https://www.gene-pi.com/item/primers-and-probes-2/

③ 引物擴增效率驗證

標準曲線是評估PCR擴增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標模板的相對數(shù)量。最常用的是10倍梯度稀釋樣品，采用標準qPCR程序進行擴增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。