生物組織的高分辨率3D熒光成像在亞細(xì)胞、細(xì)胞和組織水平上為基因表達、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞在組織中的分布研究搭建了橋梁。組織透明化方法將生物組織透明，并結(jié)合最新的3D熒光成像技術(shù)實現(xiàn)了組織結(jié)構(gòu)可視化。

盡管這種結(jié)合有諸多好處，但在3D組織成像應(yīng)用中仍存在挑戰(zhàn)：(1)在對厘米級樣本進行微米級或更高分辨率成像時，傳統(tǒng)光片顯微鏡成像效率不高；(2)傳統(tǒng)光片顯微鏡難以兼容所有的組織透明化方法透明的樣本；(3)不能實時校正由不同成像液的折射率變化引起的偏差，優(yōu)化不同樣品的成像性能；（4）顯微鏡儀器校準(zhǔn)程序復(fù)雜且較為困難。2020年11月3日，西湖大學(xué)高亮實驗室團隊在Cell Reports上發(fā)表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介紹了一款具有半自動校準(zhǔn)能力的多功能平鋪光片顯微鏡，它能夠?qū)λ�有組織透明化方法透明的樣本組織進行多色快速3D成像，并且成像的空間分辨率達微米級（4×4×10μm³）甚至亞微米級（0.3×0.3×1μm³）。另外，通過組織膨脹技術(shù)，平鋪光片顯微鏡的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm³）。

文章指出，平鋪光片技術(shù)很好地解決了上述問題。不同于其他的光片顯微鏡，平鋪光片顯微鏡不僅在透明化大組織樣本的3D成像上呈現(xiàn)更好的效果，而且可以大范圍內(nèi)更加簡單的優(yōu)化和調(diào)節(jié)成像品質(zhì)，可以更方便的應(yīng)用在不同領(lǐng)域。

那么，與其他的光片顯微鏡相比，平鋪光片顯微鏡有哪些特點呢？
1） 和傳統(tǒng)的光片顯微鏡相比，相同的成像時間里，采用平鋪光片顯微鏡成像樣本可提高空間分辨率以及成像效率。
2）通過變換不同NA的檢測物鏡，放大倍數(shù)，以及調(diào)整激發(fā)光片，平鋪光片顯微鏡可以實現(xiàn)對厘米級的組織樣本進行從微米級到亞微米級空間分辨率的成像，而利用組織膨脹技術(shù)可以進一步提高成像分辨率。
3）通過空間光調(diào)制器對激發(fā)光片進行相位調(diào)制，用于創(chuàng)建和優(yōu)化樣品照明的平鋪光片。
4）顯微鏡具有半自動校準(zhǔn)功能，保證了成像的準(zhǔn)確性、可靠性和易用性；
5）顯微鏡與所有的組織透明化方法兼容，適用于不同形狀，不同機械強度的組織成像。
6）不同的透明化組織樣本可以在幾分鐘內(nèi)快速更換成像；
7）可以對透明化組織進行多分辨率級別、各向同性、多色三維成像；
憑借上述優(yōu)點，平鋪光片顯微鏡對組織樣本進行3D成像的結(jié)果又如何呢？

1）實現(xiàn)微米級空間分辨率的3D組織成像
具有近乎各向同性的微米級空間分辨率的3D組織成像非常適合在細(xì)胞水平上可視化組織結(jié)構(gòu)。如圖1所示，3小時內(nèi)獲取的小鼠腦血管網(wǎng)絡(luò)展示了識別到的幾乎所有的毛細(xì)血管。成像結(jié)果可對腦血管結(jié)構(gòu)提供清晰的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)闡釋。根據(jù)成像結(jié)果提取到的數(shù)據(jù)顯示大腦皮層中這些穿透性的血管可通過毛細(xì)血管與位于胼胝體區(qū)域的海馬內(nèi)小靜脈或小動脈相連接。因此，平鋪光片顯微鏡卓越的3D成像能力可以輔助了解整腦不同腦區(qū)的血管網(wǎng)絡(luò)分布。

 

2）多色3D組織成像能力
多色3D成像技術(shù)對研究組織內(nèi)部不同細(xì)胞器的相對分布有極大幫助。平鋪光片顯微鏡具有對所有波段的激發(fā)光進行相位調(diào)制的功能，可以確保不同激發(fā)光束共線校正，從而確保不同顏色通道采集圖像的精確配準(zhǔn)。本文通過雙色標(biāo)記的小鼠乳腺成像來檢測顯微鏡的多色3D成像能力。圖2（A-Y）小鼠乳腺雙色成像結(jié)果表明可以清晰分辨位于乳腺管內(nèi)層的腔細(xì)胞，及乳腺管外層的基底細(xì)胞。這兩者的相對表達體現(xiàn)了乳腺導(dǎo)管和末端芽的不同分布模式，結(jié)果表明了乳腺細(xì)胞組成的空間異質(zhì)性。
圖2（Z-GG）展示了對人類的乳腺癌組織和相鄰的正常乳腺組織進行成像。從實驗表達結(jié)果可以看出，腫瘤組織失去了原有腺泡結(jié)構(gòu)僅有異常的管狀結(jié)構(gòu)，并顯示出具有利于癌細(xì)胞浸潤的密集血管脈絡(luò)系統(tǒng)。該患者的淋巴結(jié)腫大并伴有可疑的浸潤細(xì)胞，這與脈管系統(tǒng)異常的表征相符。該組實驗表明組織透明化和高分辨率3D組織成像技術(shù)在病理學(xué)應(yīng)用中的價值。


3）亞微米級空間分辨率的3D組織成像
   為觀察亞細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)，將平鋪光片顯微鏡的檢測物鏡提升至1.0NA，照明物鏡提升至0.28NA，產(chǎn)生1um薄光片對樣本進行成像。如圖3所示，成像結(jié)果呈現(xiàn)出高倍顯微鏡具有很好的亞細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的分辨能力，我們可以觀察到興奮性錐體神經(jīng)元、神經(jīng)元軸突上清晰可辨的樹突棘和單個神經(jīng)元的形態(tài)。


4）組織膨脹的亞微米級空間分辨率的3D組織成像
組織膨脹技術(shù)提供了一種比顯微鏡更高的空間分辨率來分辨組織結(jié)構(gòu)的解決方案。實驗研究了平鋪光片顯微鏡與組織膨脹技術(shù)結(jié)合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠腦透明化使用組織膨大技術(shù)將樣本各向同性擴大5倍，成像空間分辨率為2um×2um×5um，那么同等的空間分辨率根據(jù)5倍膨脹比例，映射到對實際樣本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像結(jié)果如圖4所示，小鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞和亞細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰可見，盡管海馬區(qū)細(xì)胞密度較高，依舊可以分解出單個神經(jīng)元軸突和樹突棘。同時，如圖4虛線框內(nèi)標(biāo)識可以觀察到一些神經(jīng)軸突的神經(jīng)間的軸漿運輸。

 
5) 用組織膨脹技術(shù)實現(xiàn)100nm以下空間分辨率的3D組織成像
平鋪光片顯微鏡通過采用更高NA的檢測物鏡和更薄的光片對膨脹組織成像，能夠達到100nm以下的空間分辨率，從而實現(xiàn)對組織結(jié)構(gòu)的進一步解析。
圖5采用0.8NA的檢測物鏡以及更薄的激發(fā)光片展示了更精細(xì)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，納米尺度空間分辨率的3D成像對完全解析大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是非常必要的。

  6) 具有多分辨率尺度的三維組織成像
  平鋪光片顯微鏡的優(yōu)勢是可以為其他生物組織的研究提供幫助。圖6展示了平鋪光片顯微鏡對透明化的真渦蟲以從微米到亞微米多種空間分辨率成像的結(jié)果。整體成像結(jié)果展示了干細(xì)胞在真渦蟲內(nèi)的整體分布，局部高空間分辨率成像結(jié)果展示了真渦蟲內(nèi)干細(xì)胞組織以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系。因此，平鋪光片顯微鏡可以更好地研究真渦蟲干細(xì)胞的分布和功能。類似的優(yōu)點同樣適用于其他生物研究，例如秀麗隱桿線蟲，黑腹果蠅，斑馬魚等。

 
 
結(jié)論
綜上所述，本文開發(fā)了一款多功能平鋪光片顯微鏡，具有卓越的多色3D成像能力，能夠以微米級至100nm以下的空間分辨率對厘米級的透明化樣本組織進行快速3D成像。該顯微鏡兼容所有的組織透明化方法，靈活適應(yīng)不同的應(yīng)用。它還具有通過相位調(diào)制實現(xiàn)半自動對準(zhǔn)的能力，操作簡單可靠。因此，平鋪光片顯微鏡使得3D透明化組織成像在生物醫(yī)學(xué)研究中更加可靠及可行。
 
上述平鋪光片技術(shù)已由锘海生命科學(xué)商業(yè)化——NuohaiLS18平鋪光片顯微鏡，同時，我們依托LS18光片顯微鏡搭建了锘海生命科學(xué)一站式服務(wù)平臺，為廣大客戶提供專業(yè)的生物組織透明化、免疫染色、平鋪光片顯微鏡3D熒光成像、數(shù)據(jù)分析、數(shù)據(jù)存儲等一站式科研服務(wù)，旨在通過精準(zhǔn)、快速、多樣化的科研服務(wù)為每一位生命科學(xué)工作者提供個體化/定制化的解決方案。
 
文獻鏈接：:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108349