利拉魯肽的結構如圖 1 所示（賴氨酸 (Lys )側鏈親脂性基團(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的存在可以延長藥物的半衰期）。
在利拉魯肽固相全合成的實際操作中發(fā)現(xiàn)，N 端的第4個或者是第5個氨基酸常存在偶聯(lián)不完全的情況。需過量投料，其效率不高，不利于純化。
全保護片段縮合策略是對固相合成的一種補充，但對于片段較長的情況，又存在全保護肽溶 解性差、反應效率低的問題。
 
絲氨酸/蘇氨酸對接法
絲氨酸/蘇氨酸對接法是在常規(guī)化學連接策略的基礎上發(fā)展起來的一種片段對接方法。
與常規(guī)化學連接依賴硫酯和半胱氨酸(Cys)側鏈巰基(-SH)的特異性反應不同；絲氨酸/蘇氨酸對接法主要依靠絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)側鏈羥基與醛基的亞胺捕獲反應實現(xiàn)連接。
該方法的原理是將一個組分的C端轉化為水楊醛酯再與另一組N端絲氨酸/蘇氨酸反應，所得中間體經(jīng)酸處理；N，O-苯亞甲基乙縮醛部分發(fā)生開環(huán)，脫去縮醛，變成肽鍵得到目標產(chǎn)物。目前，這一策略主要應用于糖肽、核蛋白及一些環(huán)狀肽的制備。
 
利用蘇氨酸對接法實現(xiàn)利拉魯肽片段組氨酸甘氨酸 ( His -Gly) 與片段蘇氨酸-甘氨酸 (Thr -Gly)的連接，合成了利拉魯肽的主鏈。先通N-芴甲氧羰基甘氨酸水楊醛酯(Fmoc-Gly-OSAL) 與蘇氨酸苯甲醇酯(H-Thr-OBzl)的模板反應優(yōu)化了蘇氨酸對接反應的條件，發(fā)現(xiàn)以醋酸/吡啶為溶劑時，底物轉化效率高。
研究了利拉魯肽片段對接的2種路線：
①先片段連接再進行側鏈修飾；
②先修飾再進行片段連接。
研究發(fā)現(xiàn)先進行片段對接，再進行側鏈修飾的路線效率更高，室溫下反應4 h底物可完全轉化，中間體經(jīng)三氟乙酸(TFA)處理，一步完成開環(huán)與保護基的脫除，對接收率達 76. 4%。接著對 Lys側鏈(N-棕櫚酰-γ-谷氨酸)的修飾反應進行研究，發(fā)現(xiàn)在 pH=10～12的水/乙腈溶液中反應時，能以較高的產(chǎn)率獲得目標修飾產(chǎn)物。
1.
先片段對接，再進行側鏈修飾
將其序列分割為全保護片段叔丁氧羰基-組氨酰(三苯甲基)-丙氨酰-谷氨酰(叔丁基)-甘氨酸［Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH］和脫保護片段Thr-Gly，分別進行合成。將全保護片段4的C端修飾為水楊醛酯，與片段6的N端Thr進行對接。Lys側鏈修飾。
 
全保護肽Boc-His(Trt)-Ala-Glu(tBu)-Gly-OH合成:
以2-氯三苯甲基氯(CTC)樹脂為載體，采用芴甲氧羰基(Fmoc)策略進行固相合成。在 DCM/AcOH體積比為95：5的條件下進行裂解，減壓蒸除溶劑，得到油狀物1。
脫保護肽段Thr-Gly的合成:
以Wang樹脂為載體，采用Fmoc策略進行固相合成，在TFA/TIS/H2O體積比為95∶2.5∶2.5的條件下進行裂解，將反應液加入冰乙醚中沉降，得到白色固體3。
四肽水楊醛酯的合成:
將化合物1溶于DCM中，加入DMAP、DIC、水楊醛和無水硫酸鈉，于30℃下攪拌反應約4h過濾除去固體，濾液減壓蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚體積比為1∶5～4：1),得白色固體2。
按圖示路線合成化合物4～6。
對接中間體的合成:
將化合物2溶于醋酸/吡啶(摩爾比 3∶1)混合溶液中，加入肽段3，室溫下攪拌反應約4 h。冷凍干燥除去溶劑，得粗產(chǎn)品油狀物4，不經(jīng)純化，直接用于下一步反應。
線性肽組氨酸甘氨酸(His-Gly)的合成:
將化合物4粗產(chǎn)品溶于TFA/TIS/H2O(體 積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應 40 min；反應液經(jīng)半制備高效液相色譜(HPLC)純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末5。
利拉魯肽的合成:
Pal-Glu-OtBu與N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)的酯化，得白色固體N-棕櫚酰-谷氨酸(γ-琥珀酰亞胺酯)叔丁酯［Pal-Glu(OSu)-OtBu]，不用純化直接使用。
將化合物5溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入DIEA調(diào)節(jié)溶液pH10～11。將Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續(xù)反應30 min。冷凍干燥除去溶劑，殘余物溶于TFA /H2O(體積比95∶5)混合溶液中，室溫下反應 30 min。經(jīng)半制備 HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末6，即利拉魯肽。
2.
先修飾后連接合成利拉魯肽
 
利拉魯肽側鏈修飾反應
Lys的側鏈氨基與Pal-Glu(Osu)-OtBu進行偶聯(lián)反應得到中間體，中間體經(jīng)酸處理脫除tBu保護基。由于精氨酸的側鏈胍基(pKa =12.5)有較強的堿性，可控制體系的pH在10～11范圍內(nèi)，使其質子化，不與OSu酯發(fā)生反應; 序列中的其它堿性基團，如N端氨基(pKa=9.5)，其親核性低于 Lys20側鏈氨基(pKa=10.5)，因此偶聯(lián)反應會優(yōu)先發(fā)生在 Lys側鏈。
 
Thr-Gly側鏈修飾產(chǎn)物4的合成:
將化合物3溶于水/乙腈(體積比3∶1)混合溶液中，加入 DIEA 調(diào)節(jié)溶液pH10～11。將 Pal-Glu(OSu)-OtBu溶于乙腈中，逐滴加入到上述溶液中，滴加完畢，繼續(xù)反應 30 min。經(jīng)半制備 HPLC 純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末。
對接中間體5的合成:
將化合物2和四肽水楊醛酯溶于醋酸/吡啶(摩爾比3∶1)混合溶液中，室溫下反應6 h．冷凍干燥除去溶劑，得粗產(chǎn)品油狀物5，不用純化，直接用于下一步反應。
利拉魯肽的合成:
將化合物5粗產(chǎn)品溶于TFA /TIS /H2O(體積比95∶2.5∶2.5)混合溶液中，室溫下反應 30 min;反應液經(jīng)半制備HPLC純化(乙腈/水)，冷凍干燥得白色粉末產(chǎn)物利拉魯肽。
利拉魯肽(Liraglutide)是一種重要的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，于 2010 年被美國食
品藥品監(jiān)督管理局( FDA) 批準上市，用于治療Ⅱ型糖尿病。
 
《蘇氨酸對接法合成利拉魯肽》