隨著組織透明化技術(shù)和光片熒光顯微技術(shù)的發(fā)展，3D熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)了快速獲取3D組織信息的能力。光片顯微鏡由于其獨(dú)特的3D成像能力以及更快的成像速度逐漸成為生命科學(xué)研究中3D熒光成像的強(qiáng)有力工具。光片顯微鏡的實(shí)現(xiàn)方式是將激發(fā)光片限制在探測焦平面內(nèi)，使得激發(fā)光對樣品的光漂白和光毒性降到最低，具有高的三維空間分辨率和良好的光學(xué)層析能力。

 

在光片顯微鏡中，光片越薄，光片層析能力越好，軸向分辨率越高；光片越厚，光學(xué)層析能力減弱，軸向分辨率變差。由于高斯光束的截面半徑連線為雙曲線，光片在沿著光傳播的方向上無法一直保持厚度一致，光片較薄也就是軸向分辨率最好的一段被稱為束腰。通常，我們以光片束腰的長度作為選擇視野大小的依據(jù)。束腰的長度與光片的厚度是正相關(guān)的，要想獲得更高的軸向分辨率，光片就需要更薄，束腰就會越短，相應(yīng)的視場就越��；同理，想要獲取更大的視場，光片就越厚，束腰更長，相應(yīng)的光學(xué)層析能力減弱、軸向分辨率降低。那么如何制作一個薄且均勻的激發(fā)光片來覆蓋大的FOV（Field of view），并盡可能將激發(fā)光限制在探測焦平面附近呢？

 

為尋求空間分辨率、光學(xué)層析能力和FOV之間的最佳平衡，最大限度地發(fā)揮光片熒光顯微鏡的3D成像能力，西湖大學(xué)高亮實(shí)驗(yàn)室提出了平鋪光片技術(shù)的概念，旨在滿足兩個要求：首先，顯微鏡可以實(shí)現(xiàn)最新的選擇性照明光片，以便在不同的應(yīng)用中發(fā)揮其優(yōu)勢，并且可以快速調(diào)整光片以實(shí)時(shí)優(yōu)化成像性能；其次，可以在檢測圖像平面內(nèi)快速平鋪光片以擴(kuò)大視野且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力�；�于平鋪光片技術(shù)，高亮實(shí)驗(yàn)室與锘海生命科學(xué)共同研制了新型平鋪光片照明顯微鏡LS18。

 

 

傳統(tǒng)光片顯微鏡的成像方式是怎么樣的？

 

光片顯微鏡對一個大的樣品組織進(jìn)行三維成像時(shí)需要將樣本細(xì)分成多個ROI（Region of interest）成像。這種方式本質(zhì)上是光片顯微鏡中空間分辨率和視場大小之間的折衷。

 

如圖1所示，在較大的FOV下，采用一個較長的光片激發(fā)成像，該方式成像的特點(diǎn)在于它的成像速度快，采集圖像的數(shù)據(jù)量小，且整個樣品被劃分的ROI較少，圖像三維重構(gòu)相對容易。然而，由于此時(shí)用的放大倍數(shù)較小，視野大的同時(shí)，光片也較厚，因此光片的層析能力也大幅度降低，成像結(jié)果不但在橫向上的分辨率較低，其軸向上的分辨率也更低。

 

 

圖1 大的FOV下，傳統(tǒng)光片顯微鏡成像模式

 

 

這時(shí)，研究者若想獲取更高空間分辨率的3D成像數(shù)據(jù)，就需要使用更大的放大倍數(shù)并且采用更薄的光片。那么，成像的FOV縮小，樣本成像細(xì)分的ROI將增多（如圖2所示），導(dǎo)致樣品在橫向上的平移次數(shù)增加，此時(shí)采用的光片更薄，使得軸向上步進(jìn)減小，樣品成像的速度變慢。樣品成像時(shí)間及采集數(shù)據(jù)大小會隨著空間分辨率的增高而增加。此時(shí)圖像重建工作量也將大幅度增大，主要原因有： 1. 采集數(shù)據(jù)大小明顯增大；2. 需要在ROI之間做更多的圖像拼合處理；3. 一些透明化方法處理的樣品較軟，且成像液的粘度較高，頻繁移動可能使樣品在成像過程中產(chǎn)生形變，給數(shù)據(jù)拼合增加困難。因此，樣品在橫向上的平移速度必須足夠慢，以盡量減少3D重建的問題，這就進(jìn)一步降低了樣品成像速度。

 

 圖2 高分辨率下，傳統(tǒng)光片顯微鏡的成像方式

 

 

 

什么是平鋪光片技術(shù)？

 

平鋪光片技術(shù)是一種新型的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）三維成像技術(shù)，在不增加光片厚度、不降低激發(fā)光片約束能力的情況下，增加SPIM的FOV。如圖3所示，在探測焦平面內(nèi)沿光片長軸方向(y方向)平鋪小而薄的光片，在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合并重建整個FOV的圖像。

圖3. TLS-SPIM的工作原理，（左）通過快速平鋪小而薄的光片，（右）在每個位置拍攝一幅圖像，將所有圖像組合重建整個FOV的圖像。

 

 

 

 

LS18是如何實(shí)現(xiàn)快速高分辨3D成像的？

 

LS18光片顯微鏡采用平鋪光片技術(shù)，通過對空間光調(diào)制器加載不同的相位圖對激發(fā)光束進(jìn)行調(diào)制，實(shí)現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，擴(kuò)大了FOV且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，從而獲得均一的高分辨率3D圖像。而空間光調(diào)制器對激發(fā)光相位進(jìn)行調(diào)制幾乎可以解決所有的光片校準(zhǔn)問題，真正地實(shí)現(xiàn)顯微鏡儀器的自動校準(zhǔn)，并且性能非常穩(wěn)定。另外，根據(jù)不同樣品的研究需求，LS18光片顯微鏡能夠靈活地調(diào)整光片平鋪次數(shù)以及成像速度，實(shí)現(xiàn)不同類型的完整組織器官的3D精準(zhǔn)結(jié)構(gòu)與功能測量。
 

如圖4所示，相同的樣本，平鋪光片顯微鏡在較大的FOV下，快速平鋪小而薄的光片，達(dá)到視野內(nèi)成像分辨率均一，在不增加樣本平移和圖像重建問題的前提下，可以獲得更高的空間分辨率、更好的光學(xué)層析能力和更快的成像速度。此外，平鋪光片顯微鏡采用長工作距離、高數(shù)值孔徑物鏡和高分辨率檢測相機(jī)，使得單個ROI視野盡可能大，并保持橫向空間分辨率，從而盡可能地發(fā)揮使用平鋪光片的優(yōu)勢。

 

圖4 高的空間分辨率下，平鋪光片顯微鏡的成像模式

 

 

參考文獻(xiàn)：

1、Gao, Liang. Extend thefield of view of selective plan illumination microscopy by tiling theexcitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2、Fu Q , Martin B L ,Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimizedtiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications,2016, 7:11088.

3、Chen Y , Li X , ZhangD , et al. A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Cleared TissuesImaging[J]. bioRxiv 829267, 2020

 

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