中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)吳緬教授團隊多年來在腫瘤細胞凋亡/生存的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子機制，非編碼RNA調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機理，p53與細胞代謝及誘導(dǎo)性多能干細胞調(diào)控的分子機制方面做出了很多開創(chuàng)性的研究成果。近期，研究團隊應(yīng)用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達系統(tǒng)以及沒有p53表達的H1299人肺腺癌細胞的lncRNA表達譜進行了研究，研究篩選出了一個受p53調(diào)控的lncRNA GUARDIN，一系列功能機制實驗研究表明p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN對穩(wěn)定狀態(tài)下和暴露于外源性遺傳毒性脅迫后維持基因組完整性非常重要，GUARDIN主要通過競爭性結(jié)合miR-23a調(diào)控TRF2的表達，以及作為支架分子促進BRCA1和BARD1的結(jié)合維持BRCA1的穩(wěn)定性來發(fā)揮相應(yīng)功能。該研究表明GUARDIN可以作為癌癥治療的潛在新靶標，相關(guān)研究成果發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Cell Biology（IF =20.06）雜志上。（芯片實驗由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景

基因組穩(wěn)定性的維持是一切生命活動的基礎(chǔ)，DNA損傷和復(fù)制應(yīng)激都將影響基因組的穩(wěn)定性。研究顯示，DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。為了應(yīng)對代謝活動或者環(huán)境損害導(dǎo)致的DNA損傷，細胞會不間斷激活DNA損傷應(yīng)答（DDR），識別和修復(fù)DNA損傷以維持基因組穩(wěn)定性。腫瘤抑制因子p53是DDR重要的調(diào)控因子，通過細胞周期阻滯促進DNA修復(fù)，并通過誘導(dǎo)細胞凋亡消除具有嚴重DNA損傷的細胞，維護基因組的穩(wěn)定，從而抑制腫瘤的形成。p53的轉(zhuǎn)錄靶點包含廣泛的蛋白質(zhì)編碼基因，最近的研究揭示了許多長鏈非編碼RNA（lncRNA）能參與調(diào)節(jié)對DNA損傷的p53依賴性應(yīng)答，然而關(guān)于lncRNA是如何介導(dǎo)了腫瘤抑制因子p53的DNA修復(fù)功能目前仍然不是很清楚。

本研究中作者利用Arraystar lncRNA芯片發(fā)現(xiàn)了一種p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN對于維持基因組穩(wěn)定性是非常必要的。 GUARDIN主要是通過兩種分子作用機制來維持基因組的穩(wěn)定性：第一、作為分子海綿吸附miR-23a調(diào)控端粒重復(fù)序列結(jié)合因子（TRF2）的表達來維持染色體末端結(jié)構(gòu)的完整性；第二、作為分子支架促進BRCA1與BARD1的結(jié)合進而調(diào)控BRCA1的表達進而維持細胞的DNA修復(fù)能力，GUARDIN對于細胞存活和增殖也是必不可少的，因此，GUARDIN在癌癥治療中也有非常重要的研究意義。

研究思路

首先作者應(yīng)用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達系統(tǒng)以及沒有p53表達的H1299人肺腺癌細胞的lncRNA表達譜進行了研究，研究篩選出了一個受p53調(diào)控的lncRNA GUARDIN。qPCR驗證與芯片結(jié)果一致，生信分析發(fā)現(xiàn)GUARDIN有三個異構(gòu)體，其中最長的亞型在p53誘導(dǎo)時含量最豐富。接下來作者通過過表達/敲除p53、qPCR、WB、免疫沉淀等實驗驗證了GUARDIN是p53響應(yīng)的lncRNA。

隨后作者對GUARDIN的功能進行了研究，HTC116細胞中，敲除GUARDIN，細胞數(shù)目、細胞活力、克隆形成及異種移植物都明顯下降，表明GUARDIN是細胞存活和增殖所必需的。

最后作者對GUARDIN的分子機制進行了研究。GUARDIN主要定位于細胞質(zhì)中，因此作者通過miRDB數(shù)據(jù)庫對其結(jié)合的miRNA進行了分析，發(fā)現(xiàn)GUARDIN可以結(jié)合miR-23a，隨后通過miR-23a模擬物/抑制劑熒光素酶報告檢測及pull down等實驗證明GUARDIN可以結(jié)合miR-23a且主要發(fā)生在細胞質(zhì)中。同時通過敲除GUARDIN及anti-miR-23a發(fā)現(xiàn)，GUARDIN可以調(diào)控miR-23a的靶基因TRF2的表達。接下來作者通過RNA pull down結(jié)合質(zhì)譜以及RIP、WB等實驗，發(fā)現(xiàn)GUARDIN可以和BRCA1以及BARD1相互作用，通過敲除及突變GUARDIN外顯子實驗，證明GUARDIN可以作為分子支架介導(dǎo)BRCA1與BARD1的相互作用來調(diào)控BRCA1的表達。然后作者通過DNA損傷彗星實驗發(fā)現(xiàn)，GUARDIN敲除后，DNA損傷加劇等，表明了GUARDIN對基因組穩(wěn)定性的作用，而且TRF2和BRCA1共同過表達可以消除GUARDIN下調(diào)引起的DNA損傷。上述實驗表明GUARDIN可以通過調(diào)控TRF2和BRCA1的表達促進基因組穩(wěn)定性。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1 芯片篩選lncRNA驗證及GUARDIN受p53調(diào)控分析結(jié)果

圖2 GUARDIN功能研究結(jié)果，對細胞存活和增殖是必需的

圖3 GUARDIN機制研究結(jié)果，可競爭性結(jié)合 miR-487b調(diào)控TRF2表達以及介導(dǎo)BRCA1和BARD1互作調(diào)控BRCA1表達

圖4 GUARDIN機制研究結(jié)果，通過調(diào)控TRF2和BRCA1維持基因組穩(wěn)定性

研究意義

在這項研究中，研究人員通過Arraystar lncRNA芯片篩選出了p53響應(yīng)的lncRNA GUARDIN，通過一系列功能機制實驗表明GUARDIN競爭結(jié)合mi-23a促進TRF2表達，維持染色體末端結(jié)構(gòu)的完整性，GUARDIN促進BRCA1與BARD1的結(jié)合而穩(wěn)定BRCA1，維持細胞的DNA修復(fù)能力。GUARDIN對細胞存活和增殖也是必需的，具有潛在的抑癌效應(yīng)，可能成為癌癥臨床藥物治療的潛在靶標。

原文出處

GUARDIN is a p53-responsive long non-coding RNA that is essential for genomic stability. Nature Cell Biology, 2018