Small RNA-seq數(shù)據(jù)量那么少，又不需要重新比對定量，簡簡單單的做個(gè)差異分析、畫個(gè)圖（火山圖、heatmap）、PCA、相關(guān)性計(jì)算、篩選下差異基因、預(yù)測下miRNA的靶基因，靶基因GO&KEGG注釋，使用SBC ToolBox三下五除二，只要你手速快，結(jié)果就立馬展現(xiàn)你的面前。

 

在上一期內(nèi)容中，我們通過介紹「數(shù)據(jù)認(rèn)知」、「模塊登錄」與「差異分析」，初步了解了使用SBC ToolBox對Small RNA-seq定量數(shù)據(jù)分析的流程，本期緊接上述內(nèi)容，為您介紹更多模塊。

 

 

四 SBC ToolBox檢驗(yàn)樣本重復(fù)性模塊

i. PCA分析

a) 登錄PCA分析模塊，先登錄SBC ToolBox導(dǎo)航頁面，側(cè)邊欄找到并點(diǎn)擊點(diǎn)圖按鈕，點(diǎn)擊PCA模塊。

 

 

b) 進(jìn)入PCA模塊，界面展示

 

 

c) 上傳數(shù)據(jù)提交分析   

    1. 上傳數(shù)據(jù)：上傳CPM數(shù)據(jù)定量結(jié)果及樣本對應(yīng)分組文件用于顏色匹配。   

    2. 示例數(shù)據(jù)：具體格式參考差異分析，也可以點(diǎn)擊下載示例數(shù)據(jù)進(jìn)行修改。

 

 

d) 提交分析，結(jié)果即時(shí)反饋在主界面上，如下圖所示，調(diào)整輸出圖片的寬和高，點(diǎn)擊下載保存按鈕即可將PCA結(jié)果保存到本地。

 

ii. 相關(guān)性分析

a) 登錄相關(guān)性熱圖分析模塊，先登錄SBC ToolBox導(dǎo)航頁面，側(cè)邊欄找到并點(diǎn)擊熱圖按鈕。

b) 上傳表達(dá)數(shù)據(jù)直接相關(guān)性計(jì)算，主界面會展示相關(guān)性熱圖，結(jié)果可以保存相關(guān)圖和樣本間相關(guān)性系數(shù)。

這里只需要上傳CPM數(shù)據(jù)即可，詳細(xì)參考PCA分析的定量數(shù)據(jù)，也可以在應(yīng)用操作指南界面找到示例數(shù)據(jù)。

c) 上傳數(shù)據(jù)提交分析結(jié)果如下：

d) Heatmap 添加分組bar展示

    1. 登錄分組熱圖展示：

    2. 上傳數(shù)據(jù)，這里需要相關(guān)性系數(shù)矩陣和樣本對應(yīng)的分組文件，跟PCA和相關(guān)性分析一致，同樣可以在應(yīng)用操作指南頁面找到示例數(shù)據(jù)。

    3. 提交分析：

 

iii. 層級聚類分析

a) SBC ToolBox 導(dǎo)航頁面?zhèn)冗厵邳c(diǎn)擊線圖按鈕，進(jìn)入層級聚類圖模塊。

b) 上傳提交數(shù)據(jù)，這里使用的數(shù)據(jù)與PCA分析所需數(shù)據(jù)一致，也是定量數(shù)據(jù)和樣本分組數(shù)據(jù)，這里直接上傳PCA分析使用數(shù)據(jù)即可，提交分析層級聚類結(jié)果就展示在主界面上。

c) 調(diào)整樹形結(jié)構(gòu)為環(huán)形結(jié)構(gòu)。

層級聚類圖，線的顏色隨著Cluster數(shù)量改變而改變，標(biāo)簽的顏色隨著分組的數(shù)量而改變。

 

五 SBC ToolBox差異數(shù)據(jù)展示模塊

i. 火山圖

a) 完成差異計(jì)算，想要展示差異基因的分布情況，一般會使用火山圖來進(jìn)行展示，火山圖需要主要使用Pvalue和FC進(jìn)行展示。

b) 登錄SBC ToolBox火山圖來畫一個(gè)專屬的火山圖，進(jìn)入SBC ToolBox導(dǎo)航頁，側(cè)邊欄點(diǎn)擊點(diǎn)圖按鈕，點(diǎn)擊火山圖模塊進(jìn)入火山圖主界面。

 

c) 上傳數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)格式，打開沒有篩選Pvalue和FC的差異表格，保留以下四列數(shù)據(jù)，第一列為RNA信息，第二列為Pvalue，第三列為logFC，第四列用于RNA標(biāo)記，一般為GeneSymbol，這里沒有，可以直接手搓數(shù)據(jù)-復(fù)制粘貼第一列。

d) 提交分析，這里可以根據(jù)自己的喜好調(diào)整上下調(diào)顏色，基因的標(biāo)記，信息，P&FC閾值，自定義專屬火山圖。

 

ii. Heatmap

a) 差異基因的Heatmap可以使用熱圖模塊完成展示，一共有三個(gè)，簡單熱圖、分組添加bar熱圖、復(fù)雜熱圖。下面使用復(fù)雜熱圖來展示差異基因的Heatmap。

b) 登錄SBC ToolBox側(cè)邊欄找到熱圖，點(diǎn)擊ComPlexHeat模塊。

c) 上傳數(shù)據(jù)說明：數(shù)據(jù)第一列為基因信息，剩余列為基因?qū)��?yīng)樣本的表達(dá)信息，數(shù)據(jù)排列如下，也可以在應(yīng)用操作指南找到示例數(shù)據(jù)。

d) 隱藏行名，展示目標(biāo)基因，對行和列進(jìn)行分割，提交分析結(jié)果如下。

根據(jù)實(shí)際需求，可以調(diào)整色階的變化，是否中心化處理等操作。

 

六 靶基因的GO&KEGG注釋

完成miRNA的靶基因預(yù)測，如何使用SBC ToolBox對靶基因進(jìn)行GO & KEGG注釋？SBC ToolBox有專屬的富集分析模塊提供GO和KEGG注釋。

 

i. GO注釋

a) SBC ToolBox導(dǎo)航頁找到 GO分析 模塊，點(diǎn)擊進(jìn)入

b) 將靶基因的GeneSymbol列復(fù)制粘貼到GO注釋文本框中，下單物種菜單，選擇正確的物種信息，提交分析，即可完成GO注釋分析，默認(rèn)是使用DotPlot展示方式進(jìn)行可視化GO注釋結(jié)果。

c) 對默認(rèn)的可視化結(jié)果不滿意，可以登錄GO bachart或者Dotchart進(jìn)行展示

    1. GO Barchart & DotChart，SBC ToolBox可以找到

    拖拽或者上傳GO注釋分析.xlsx結(jié)果到BarChart模塊，提交分析。

    2. GO DotChart 將GO注釋結(jié)果上傳至Dotchart模塊，提交分析。

ii. KEGG注釋

a) 操作方式請參考GO注釋流程。

 

完成以上分析，一套完整的Small RNA-seq定量下游數(shù)據(jù)分析的大部分內(nèi)容就基本上圓滿了，回顧一下流程：

SBC ToolBox生信云所見及所得，讓你的數(shù)據(jù)分析變得簡單起來。