Journal of Neuroscience Methods 151 (2006) 276–286

Application of multiline two-photon microscopy to functional in vivo imaging

Rafael Kurtz a,∗, Matthias Fricke b,1, Julia Kalb a,2,

Philip Tinnefeld b,3, Markus Sauer b,4

a Lehrstuhl f¨ur Neurobiologie, Universit¨at Bielefeld, Postfach 100131, D-33501 Bielefeld, Germany

b Lehrstuhl f¨ur Angewandte Laserphysik und Laserspektroskopie, Universit¨at Bielefeld,

Received 3 November 2005; received in revised form 28 November 2005; accepted 4 December 2005

    高空間分辨率和低的光損傷風險使得雙光子激光掃描顯微鏡TPLSM成為生物功能成像的選擇。但是，如神經(jīng)鈣離子調(diào)控等功能性動態(tài)研究通常也需要一個高的時間分辨率。目前，通過線掃描可以獲取速度的提升，但是將結(jié)構(gòu)的空間分辨率限制在一條軸上。為克服高空間分辨率和高時間分辨率間的空白，我們改進了TPLSM，使用一個多倍分光器來在樣品中產(chǎn)生多個激光焦點。通過使用一個電子倍增相機檢測這些焦點釋放的熒光，它可以支持同時進行多條線掃描。除了多線掃描，高達64束的陣列也允許使用X-Y掃描模式去以高的幀速獲取整幅圖像。為估測多線掃描TPLSM在功能性原位成像中的應用，監(jiān)測了蒼蠅大腦中的視覺運動神經(jīng)元中的鈣離子信號。以分枝狀軸突和棘突狀結(jié)構(gòu)的測量為例展示了我們的方法對于從不同細胞位置同時獲取信號的能力。鈣離子動態(tài)依賴于分支大小，但是“棘突”與他們的“母軸突”并沒有系統(tǒng)性的區(qū)別。我們設備的空間分辨率與激光共聚焦顯微鏡進行了嚴格比較并通過運行成像和點掃描模式直接評估圖像檢測過程中釋放光散射的負面效應。

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Keywords: Two-photon; Microscopy; Calcium imaging; Temporal resolution; Beamsplitter; Visual system; Invertebrate

    調(diào)查單個神經(jīng)細胞和神經(jīng)回路內(nèi)的動態(tài)過程通常要求對神經(jīng)活動具有高時間分辨率和空間分辨率的成像。傳統(tǒng)寬視野熒光顯微鏡對完整組織的空間分辨率受到光散射的嚴重影響。另一方面，時間分辨率受到CCD在弱光條件下獲取圖像所需時間的限制。

    激光掃描顯微鏡尤其是TPLSM，在散射性組織中可能提供了比傳統(tǒng)成像方式更高的空間分辨率，并允許基于不同焦平面的圖像系列的三維重構(gòu)(for review see: Halbhuber and K¨onig, 2003; Helmchen and Denk, 2002; Wright and Wright, 2002; Zipfel et al., 2003).激光掃描顯微鏡的更高的空間分辨率事實上取決于受到樣品內(nèi)激光焦點限制的信號檢測（共聚焦顯微鏡）或激發(fā)本身（TPLSM）。

    但是，成像速率是激光顯微鏡中的一個問題：例如，當激光沿著一個軸重復掃描時，只有在線掃描中，獲取率通�？梢陨仙�到每秒幾百個樣品。相對而言，掃描整幅圖像或者在Z平面進行圖像堆棧與傳統(tǒng)寬視場熒光成像同樣耗費時間。當在不能用單條線掃描完全涵蓋的多個神經(jīng)結(jié)構(gòu)功能性信號比較時，它存在很大的問題。不幸的是非同時性的多個線位置連續(xù)數(shù)據(jù)收集通常不是一個能說明問題的選擇，因為在實驗間變異性很大的神經(jīng)元響應中它得出的結(jié)論太間接。(see e.g. Passaglia and Troy, 2004; Warzecha and Egelhaaf,1999). 在獲取整幅圖像時提高時間分辨率的技術(shù)，例如轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡，雖然有新的發(fā)展，在活樣品的致密組織應用中獲得的信號過于微弱。 (see e.g. Coates et al., 2004; Nakano, 2002).

    在這個研究中，我們調(diào)查了是否多線TPLSM能夠幫助克服在功能性成像中時間分辨率和空間分辨率間的權(quán)衡。

    多線TPLSM的原理以基于鏡面的光束分光器為基礎，它可以把一束激光分解成多束(Nielsen et al., 2001).在TPLSM中，激發(fā)內(nèi)在性限定在激光很小的焦點處，這個分光器可以在樣品的焦平面上產(chǎn)生多個這種激發(fā)點。我們證明這種多焦點模式可以有效地用于同時執(zhí)行多個線掃描。而且，使用多激光焦點掃描時圖像的獲取速度會提高，因為每條光線只掃描圖像的一部分，或者每個樣品點被多條光束成功激發(fā)。近來，一個相似的光束分光器設計已經(jīng)被提議用到熒光壽命成像上。 (Leveque-Fort et al., 2004).

    對正常動物的成像是功能性成像最具挑戰(zhàn)性的工作 (for review see: Helmchen andWaters, 2002).我們使用蒼蠅視覺系統(tǒng)的神經(jīng)元鈣離子動態(tài)監(jiān)測作為多線TPLSM的關鍵測試。Blowfly大腦中的視覺運動處理區(qū)域，小葉板，包含了60個大的可獨立識別的方向選擇性神經(jīng)元，所謂的切向細胞TC。(for reviews see Borst and Haag, 2002; Egelhaaf and Borst, 1993; Egelhaaf et al., 1988, 2002, 2005). 這些神經(jīng)元已經(jīng)成為研究近乎自然狀況下神經(jīng)信息處理的模型系統(tǒng)。在電生理學與光學記錄實驗中，TC表現(xiàn)出作為運動感受器的功能，每一個神經(jīng)元被以一種特殊的方式裁剪以適應來自移動中眼睛產(chǎn)生的動態(tài)模式的光流信息的精確明顯的組分(D¨urr et al., 2001; Egelhaaf et al., 1993; Krapp and Hengstenberg, 1996; Single and Borst, 1998). 由于來自外周局部動作敏感神經(jīng)元的神經(jīng)信號的視網(wǎng)膜拓撲取樣TC具有大的感受域。而且，TC間的相互作用大大增加了感受野的大小和動作特異性(Haag and Borst, 2001; Horstmann et al., 2000).

    使用鈣離子成像作為TC局部樹突活化的標記(Borst and Egelhaaf, 1992; D¨urr and Egelhaaf, 1999; Haag et al., 2004; Single and Borst, 1998). 而且，有證據(jù)表明樹突鈣離子的增加卷入了活性依賴的動作靈敏度度的調(diào)控，如動作調(diào)整 (Kurtz et al., 2000). 突觸鈣離子濃度改變的成像已經(jīng)被用于描繪感受刺激中的分級突觸傳遞的特點。(Kurtz et al., 2001). 在所有這種組織中，更高空間和時間分辨率的鈣離子成像將幫助我們得出更直接的結(jié)論，例如樹突輸入整合，突觸傳導中的鈣離子動態(tài)調(diào)控和通過鈣離子的動作調(diào)節(jié)的潛在時空控制。

    除了它的優(yōu)越性能和在致密組織的深層激發(fā)過程中降低的光損傷之外，由于使用近紅外波段激發(fā)，也避免了光感受器的視覺激發(fā)，TPLSM成為原位成像中的一種方法選擇，尤其適用于視覺系統(tǒng)。(see e.g. Denk and Detwiler, 1999; Euler et al., 2002). 通常，共聚焦和傳統(tǒng)成像通常伴隨著不需要的視覺激發(fā)，因為熒光染料的單光子激發(fā)光譜與光感受器的感受范圍存在很大的重疊。蒼蠅的視覺系統(tǒng)首次被用來通過單線掃描和一個雪崩二極管監(jiān)測鈣離子信號來檢驗原位TPLSM成像(Kalb et al., 2004). 之后，Haag et al. (2004) 分析了條紋模式的動作中TC中的局部樹突鈣離子震動，以得出TC的局部動作檢測器輸入的計算模式。在后者的研究中，獲得了64×64像素的圖像，但是鈣離子成像的時間分辨率只有8Hz。相對的, Kalb et al.(2004) 獲得了高達400Hz時間分辨率的單線掃描圖像，空間分辨率限制在10um的一條線。當前的研究首次表明TPLSM中的多線原理可以被如何有效地應用以彌補神經(jīng)活動功能成像中時間分辨率與空間分辨率之間的空白。

    為了從激光掃描顯微鏡的功能性成像中得出重要結(jié)論，一個高的時間分辨率是很重要的。在低光情況下，這通常通過進行單線掃描來獲取。這被以一個垂直系統(tǒng)（VS）神經(jīng)元的突觸前分支的激光共聚焦(Leica SP2)鈣離子成像示例 (see Fig. 1, Table 1). 這類神經(jīng)元對其感受野內(nèi)的向下運動以其膜電勢的逐級去極化的方式響應，這伴隨著突觸前分支精細末端的鈣離子聚集(Kurtz et al., 2001).為達到一個高的時間分辨率(400 Hz)，執(zhí)行了單線掃描。記錄中顯示，掃描線應該擊中了不同直徑的兩個神經(jīng)元。模式運動期間鈣離子指示染料熒光相對基線熒光的增加表明了細胞溶質(zhì)自由鈣離子濃度的增加。精細神經(jīng)突中鈣離子信號變化更快，不論是刺激動作期間的上升和刺激動作中止后的下降。

Fig. 1. Top: schematic of the fly’s head (caudal view). Vertical System (VS) neurons form an ensemble of 10 cells, belonging to the visual motion-sensitive tangential cells in the fly brain. To study calcium concentration changes in these neurons the lobula plate region was exposed, a single VS2-neuron was impaled with a sharp glass electrode for intracellular recordings and the electrically charged, membrane-impermeant calcium dye Oregon-Green 488 BAPTA-1 was driven into the cell by applying hyperpolarizing current (−1 to −2 nA for 3–5 min). Bottom: single-line scans were performed at the presynaptic region of the VS2-neuron with a Leica SP2 confocal microscope equipped with a long-distance water-immersion 40×/N.A. 0.8 objective (excitation 488 nm, emission 500–560 nm, scan frequency 400 Hz). The arrow below the image of the presynaptic arborizations (left) indicates line position. During downwards motion of a squarewave grating (spatial wavelength: 32◦, temporal frequency: 4 Hz, Michelsen contrast: 99.3%) intracellular free calcium rised, leading to an increase in dye fluorescence (middle). The time course of relative fluorescence changes (_F/F0) is shown averaged over regions containing signal from the upper, thinner neurite (right, black trace) and the lower, thicker neurite, respectively (grey trace). Both the rise of the calcium signal during pattern motion and its decline afterwards appeared faster in the thin neurite. For a more detailed description of animal preparation, electrophysiological procedures and visual stimulation see Kurtz et al. (2001).

    在高度分支化的結(jié)構(gòu)，如樹突和突觸前分支中，對通過單線掃描到的個體神經(jīng)元間的鈣離子動態(tài)差異進行系統(tǒng)分析是困難的，因為是否是一個以上感興趣的區(qū)域被掃描線擊中是很難控制的。為在一定程度上解決這個問題，我們推出了一種方法，通過多束激光取代單激光束的TPLSM進行鈣離子成像。

    來自一個可調(diào)諧Ti：Sa激光器(see Table 1)的脈沖化的近紅外激光被導向一個基于鏡面的光束分光器(Nielsen et al., 2001). 光束分光器的原理是組合了一個位于中央的50%光束分光鏡和位于兩側(cè)的高反射鏡(see Fig. 2). 光束分光器將入射光分為兩束，高反射鏡將光束重復送回中央的光束分光鏡。這個過程產(chǎn)生了高達64束的成一列的激光束陣列。

    在我們早期實驗中(see also Kalb et al., 2004)使用的光束分光器包含了一個單一光學元件組，每一個元件都被固定在無振動平臺上，并可直接調(diào)整。在后期實驗中（此處所列數(shù)據(jù)都基于此實驗），為了方便，這個用戶定制的分光器被用一個新近開發(fā)的市場上可以買到的分光器(TriM-Scope, LaVision BioTec, Bielefeld, Germany)所取代。后者配置中所包括的關鍵組件有衰減器，光束望遠鏡，色散補償，光束分光器，和xy掃描振鏡，都被裝在一個盒子里。

    通過掃描器后，激光陣列從背后端口進入倒置顯微鏡(Olympus IX70)。一直暴露大腦的蒼蠅，其一個單獨的TC被鈣離子敏感染料填充以用于熒光成像，被固定在顯微鏡載物臺上。一個提供視覺刺激的LED板被放在蒼蠅視野之內(nèi)。

    在單光束TPLSM中，光電倍增管PMT或者雪崩二極管APD可以很方便地用于釋放光檢測，由于雙光子激發(fā)的原理，激發(fā)只發(fā)生在激光焦點處。因此，用于屏蔽離焦光線的共焦小孔變得不必要，并且可以使用NDD檢測。這意味著激發(fā)光不會被送回掃描鏡，而是直接進入位于靠近物鏡處的具有大的活性面積的PMT。但是，這種簡單檢測模式在多線PTLSM中卻很難實現(xiàn)，因為必須要分離出每一個激光焦點發(fā)出的熒光。因此，我們首先設想了一種使用多APD的檢測模式在非掃描模式（descanned mode）下操作。這種檢測模式的靈敏性是陽性的，在僅用一個激光束和單個APD的預實驗中(Kalb et al., 2004).但是我們抑制了安裝額外多個APD用于多線檢測的想法，因為檢測器的調(diào)整非常關鍵。取而代之的是，受到芯片信號放大的超靈敏度CCD（所謂電子增強CCD）的啟示，我們決定在non-descanned mode下使用成像設備。在這種模式下，使用同步CCD讀出光束一次或多次掃過樣品來獲取整幅圖像。這相對于使用PMT或APD的點掃描檢測，它們在每個激光焦點位置取一個值，圖像通過將這些值與激光的位置進行關聯(lián)來重構(gòu)。在散射性組織中，使用成像檢測取代點掃描檢測在一定程度上不可避免地降低了空間分辨率。如我們所示，多線TPLSM也可以進行點掃描檢測，但只能以遠低于成像檢測的時間分辨率進行（見本段后面內(nèi)容和section3對兩中檢測模式進行關鍵評估）。

Fig. 2. Schematic of multiline TPLSM. Top: principle of the mirror-based beam multiplexer as first described by Nielsen et al. (2001). A linear array of in this case eight laser beams is generated by repeated separation at a 50%-beamsplitter mirror (BS) and reflection at high-reflectivity mirrors (HR). Bottom: schematic of the components in the setup for multiline TPLSM. The laser beam of a tunable Ti:sapphire laser passes a shutter, an attenuator, a beam telescope to adjust the size of the beam, and a dispersion compensation consisting of a pair of prisms. The latter prevents elongation of laser pulses by compensating for the group velocity dispersion introduced by the glass in the optical path of the laser beam. The laser beam then enters the beam multiplexer which divides the laser beam into 64 beams. In the commercially available version of the beam multiplexer (LaVision BioTec, Bielefeld) used now in our setup the maximal number of beams can be reduced by software-controlled replacement of part of the beamsplitter mirror with a high-reflectivity mirror. However, in order to generate a beam array with widely separated laser foci (as used for the recording shown in Fig. 3B), manual blocking of some of the beams had to be used. Scan movements of the beam array are controlled by nonresonant xy-galvo-scan mirrors. Before entering the microscope (Olympus IX70), a second beam telescope is passed. The microscope long-distance water-immersion 40×/N.A. 0.8 objective was mounted on a z-piezo to control the focal plane for the acquisition of image stacks. The fly is fixed with bees wax at a small glass plate and mounted on the microscope stage to control its xy-position. Moving patterns are presented in the visual field of the fly at high contrast and fast update rate with a custom-built LED board. The microscope was not equipped with conventional epifluorescence illumination. However, delivery of excitation light (mercury lamp band-pass filtered at 420–480 nm) to the sample via a lightguide (not shown in the diagram) turned out more practical than TPLSM to localize the dye-filled neuron at the beginning of an experiment. In the first case, a 465 nm beamsplitter and a 515 nm long-pass emission filter was used. In the case of TPLSM a 680 nm beamsplitter in combination with a TP-emission filter (short pass 700 nm) was used. An EMCCD camera (Andor Ixon DV887BI) was installed for the detection of emission light.

    由于技術(shù)限制，直到現(xiàn)在，TPLSM中的成像檢測主要限制在要么提供高水平的發(fā)射光，要么不要求高的時間分辨率(see e.g. Bewersdorf et al., 1998). 為了獲取更高的可能靈敏度（進而到時間分辨率），即使在正常動物原位成像過程中的暗淡激發(fā)光情況下，我們使用了一個背景照明CCD，在500-650nm處量子效率>90%（例如，在一個包含了大多數(shù)鈣離子染料的激發(fā)峰的范圍內(nèi)）和高達1000的可變電子倍增增益因子(Andor iXon DV887BI)(Coates et al., 2004).

    我們以兩種獲取模式操作多線TPLSM：種，整個研究使用所謂“幀掃描”模式，以64束激光在X、Y方向掃描樣品。因此焦平面上激發(fā)了均一性照明，假定光束陣列的橫向步長尺寸沒有過于粗糙（通常使用≤400 nm的步長尺寸）。在Fig. 3A，展示了以“幀掃描模式”以8.2Hz獲取的一個圖像系列，顯示了來自一個VS神經(jīng)元突觸前區(qū)域在模式動作發(fā)生時神經(jīng)元的優(yōu)選方向。在偽色圖中，紅和黃色表示了鈣離子指示染料相對熒光(_F/F0)的增加，與細胞溶質(zhì)自由鈣離子濃度的局部上升相關。

    在“幀掃描模式”中，高達20Hz的獲取速度是可行的，如果神經(jīng)元有足夠高的染料著色密度。但是，大幅增加獲取速度，需要以同時記錄線掃描取代整幅圖像掃描。通過將激光束陣列的掃描動作限制在X方向上實現(xiàn)了這一點。Fig. 3B展示了以“多線掃描模式”以89.3Hz獲取的與A同一區(qū)域的數(shù)據(jù)。為避免激光束間交叉干擾，在展示的例子中我們只使用了8束相距較遠的激光束（間距大約7um）取代了完整的64束陣列。當然也可以使用更多的激光束，那么獨立光束間距會縮�。〝�(shù)據(jù)未展示）。在Fig. 3B展示的例子中，8線中的4線擊中了焦平面上VS細胞的突觸前區(qū)域。這種多線掃描的時間進程可估計等同于單線掃描的數(shù)據(jù)。

    通過多線TPLSM，相距太遠或使用單線擊中太難排列的多個神經(jīng)元的同步鈣離子信號，可以在精細時間尺度上進行比較。在Fig. 3C顯示的例子中，來自細側(cè)枝之一的鈣離子信號比來自主枝的細胞上升和下降都快得多。這一發(fā)現(xiàn)被來自低時間分辨率的“幀掃描模式”的圖像序列中不同興趣區(qū)域的鈣離子信號比較所證實(see Fig. 3C, bottom).神經(jīng)突間的表面積-體積比對這種鈣離子動態(tài)差異的貢獻已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。 (Kurtz, 2004). 一個功能上的重要意義可能存在于這個事實中，突觸前末端的快速鈣離子動態(tài)有助于加速神經(jīng)遞質(zhì)釋放的控制 (see e.g. Callaway et al., 1993; Macleod et al., 2002; Regehr and Atluri, 1995).

    通過共聚焦和TPLSM，我們能夠觀察VS神經(jīng)元軸突輸出區(qū)域小的神經(jīng)突出。這些結(jié)構(gòu)讓人聯(lián)想起哺乳動物皮質(zhì)神經(jīng)元中的分枝狀棘突，迄今為止還沒有進行TC中的功能性成像。需要注意的是，大腦嗅球細胞棘突中的這些VS細胞棘突是否是純粹的突觸前或后，或二者兼有，目前仍未知。 (Isaacson and Strowbridge, 1998).  因為在棘突和上級樹突中的鈣離子調(diào)控在皮質(zhì)棘突中起主要作用 (for review see Sabatini et al., 2001), 我們比較了VS細胞棘突和鄰近軸突干間的視覺刺激期間的鈣離子動態(tài)(Fig. 3D). 相對于從哺乳動物椎體神經(jīng)元的研究中可以期望的結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其棘突鈣離子動態(tài)快于上級樹突(Holthoff et al., 2002; Majewska et al., 2000)，棘突和上級樹突或VS神經(jīng)元獨立的棘突間不存在鈣離子信號的顯著差異。(see Fig. 3D).