腫瘤類器官培養(yǎng)和藥敏篩選中細(xì)胞因子和抑制劑的種類及作用
癌癥并不是一種單因素的疾病，在不同個(gè)體之間甚至同一個(gè)體內(nèi)部（瘤內(nèi)）都存在異質(zhì)性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試腫瘤對(duì)不同抑制劑的敏感性就成為了目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。已有的一些技術(shù)，例如腫瘤細(xì)胞系的二維培養(yǎng)、異種移植等方法，往往存在造模效率不高、難以復(fù)制體內(nèi)異質(zhì)性、基因組欠穩(wěn)定、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)等缺陷。腫瘤類器官是一種從腫瘤組織中提取的癌細(xì)胞三維培養(yǎng)物，在基因組和功能方面與原始細(xì)胞相似，是在器官水平上對(duì)原代組織的病理特征進(jìn)行模擬，可用于腫瘤生物學(xué)的研究和藥敏篩選。AbMole提供高品質(zhì)抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、靶點(diǎn)蛋白、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫(kù)、抗生素，全球大量文獻(xiàn)專利引用。
一、腫瘤類器官的培養(yǎng)
腫瘤類器官的一般培養(yǎng)流程如圖1所示，首先是獲得腫瘤組織。隨后用胰酶、膠原酶和DNA酶消化并用培養(yǎng)基重懸以獲得單細(xì)胞懸液，不同腫瘤的消化時(shí)間長(zhǎng)短有所區(qū)別。為去除未消化的細(xì)胞，還需要用特定孔徑的細(xì)胞篩過(guò)濾懸液。接著轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的基底膜提取物（BME）中，隨后將BME與腫瘤細(xì)胞的混合物滴在預(yù)熱的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板底部，將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中使BME凝固。在培養(yǎng)過(guò)程中常采用DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因其含有較為豐富的營(yíng)養(yǎng)因子，廣泛用于增殖培養(yǎng)。除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基之外，還需隨著腫瘤類型的不同而額外加入不同的細(xì)胞因子或抑制劑，但基本上都含有以下四種：
1.生長(zhǎng)因子
類器官研究中用到的生長(zhǎng)因子主要是酪氨酸受體激酶的配體，包括表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）（M9415）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）（M10353）等，上述的幾種生長(zhǎng)因子可刺激上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖1 腫瘤類器官的培養(yǎng)流程和藥敏篩選。
2.Wnt信號(hào)通路激活劑
Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在胚胎發(fā)育、癌癥以及成年動(dòng)物的正常生理過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。類器官領(lǐng)域中的Wnt激活劑主要是R-spondin 1 （RSPO1）（M15009），RSPO1可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，從而支持類器官中多種細(xì)胞類型的形成和維持。
3.TGF-β超家族抑制劑
最常使用的TGF-β抑制劑是Noggin（M9999）和A 83-01（M5037 ），A83-01是一種有效的TGF-β的I型受體ALK5、ALK4和ALK7的抑制劑，A 83-01可以抑制腫瘤類器官的增殖，有助于維持腫瘤類器官的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期增殖能力，這對(duì)于研究腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制具有重要意義。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是TGF-β超家族的一個(gè)重要亞類，Noggin通過(guò)抑制BMP信號(hào)通路的活性來(lái)維持腫瘤類器官中細(xì)胞的正常增殖和分化狀態(tài)。
4.ROCK抑制劑
Y27632（M1817）是類器官領(lǐng)域中使用最為普遍的Rho相關(guān)蛋白激酶（ROCK）的抑制劑，Y27632可以直接結(jié)合ROCK的催化位點(diǎn)以抑制其激酶活性，因此Y-27632可以間接抑制Rho介導(dǎo)的應(yīng)力纖維的形成并避免細(xì)胞因過(guò)度收縮而死亡。Y27632還可以保持干細(xì)胞的干性，對(duì)于一些離體的組織，例如腫瘤組織可以通過(guò)保存在含有Y27632的溶液中以延長(zhǎng)保存時(shí)間。
在腫瘤類器官培養(yǎng)完成后還需要進(jìn)行鑒定，可通過(guò)組織切片、HE染色、測(cè)序分析、免疫熒光等方法去驗(yàn)證腫瘤類器官與體內(nèi)腫瘤的一致性以便于開(kāi)展后續(xù)的藥敏篩選。AbMole是ChemBridge中國(guó)區(qū)官方指定合作伙伴。
二、腫瘤類器官的藥敏篩選
腫瘤類器官因其與在體腫瘤組織具有高度相似性，所以它可作為一種模型來(lái)測(cè)試腫瘤相關(guān)抑制劑或人源化單抗試劑的效果，通過(guò)結(jié)合高通量和自動(dòng)化等技術(shù)可進(jìn)一步縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，且通量較高，可短時(shí)間內(nèi)篩選出活性較強(qiáng)的抑制劑或單抗試劑（圖2）。
圖2 腫瘤類器官藥敏篩選的一般流程。
腫瘤類器官的藥敏篩選的主要流程是：首選將要篩選的抑制劑配制特定濃度的儲(chǔ)存母液，然后按照梯度稀釋至96或者384孔板中。同時(shí)構(gòu)建腫瘤類器官并將其轉(zhuǎn)入孔板中，待其培養(yǎng)完成后，按照設(shè)計(jì)好的布局加入抑制劑，最后分析對(duì)應(yīng)孔板中的細(xì)胞活力以采集IC50、腫瘤生長(zhǎng)抑制率等數(shù)據(jù)。
1.藥敏篩選文庫(kù)的組成
藥敏篩選的文庫(kù)一般是一些常見(jiàn)的抗腫瘤抑制劑或者人源化單抗試劑，并且還可以按照設(shè)計(jì)好的方案進(jìn)行聯(lián)合藥敏測(cè)試。這里需注意的是由于類器官不具有完整的機(jī)體代謝能力和環(huán)境，因此待測(cè)對(duì)象一般選擇其活性形式而非前體。常見(jiàn)的抗腫瘤抑制劑包括：Afatinib（M1677）、Cisplatin（M2223）、Dabrafenib（M1988）、LY2157299（M1980）、Selumetinib（M1661）等，它們可以抑制DNA合成和特定的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)通路如EGF、TGF-β等，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。人源化單抗是近些年關(guān)注度極高的腫瘤靶向產(chǎn)品，這種特殊設(shè)計(jì)的單克隆抗體可結(jié)合腫瘤細(xì)胞并通過(guò)多種方式發(fā)揮作用：阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路、通過(guò)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）、阻止腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸、抑制血管生成等。在結(jié)合基因工程手段對(duì)抗體進(jìn)行人源化后進(jìn)一步降低了單抗的免疫原性，其抑制效果得到了進(jìn)一步的改善，目前常見(jiàn)于腫瘤藥敏篩選的人源化單抗試劑主要有：用于免疫檢查點(diǎn)抑制的納武利尤單抗（Nivolumab，M6100）、帕博利珠單抗（Pembrolizumab，M6102）和曲美木單抗（Tremelimumab，M25253），用于血管生成抑制的貝伐珠單抗（Bevacizumab，M6166），以及靶向抑制單抗如帕尼單抗（Panitumumab，M1503）、 帕妥珠單抗（Pertuzumab，M6221）等。
2.細(xì)胞活力檢測(cè)
以往對(duì)二維培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行活力檢測(cè)時(shí)常用的方法是MTT，但是對(duì)于三維體系細(xì)胞的檢測(cè)而言上述方法由于滲透不佳、分布不均等問(wèn)題導(dǎo)致準(zhǔn)確度較差。增強(qiáng)型ATP細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒（M55403）采用生物發(fā)光法，即利用熒光素酶與其底物熒光素之間的反應(yīng)產(chǎn)生熒光，該反應(yīng)需要消耗ATP并且發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度與ATP的量呈正比（圖3），由于ATP存在于所有代謝活躍的細(xì)胞中，而在死細(xì)胞中幾乎不存在，因此是鑒定活細(xì)胞最合適的標(biāo)志物之一。增強(qiáng)型ATP細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括：超高信號(hào)穩(wěn)定性、超高靈敏度、超寬線性范圍，目前已成腫瘤類器官研究領(lǐng)域細(xì)胞活力檢測(cè)的最佳方案。
圖3 增強(qiáng)型ATP細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理。
腫瘤類器官培養(yǎng)常用產(chǎn)品：
EGF (M9415)、FGF-10/KGF-2(M10353)、Noggin(M9999)、R-spondin 1/RSPO1(M15009)、Y-27632(M1817)。
EGF (M9415)、FGF-10/KGF-2(M10353)、Noggin(M9999)、R-spondin 1/RSPO1(M15009)、Y-27632(M1817)。
腫瘤藥敏篩選（常見(jiàn)抑制劑）：
Afatinib(M1677)、Aldosterone(M7617)、Cabozantinib(M1757)、Carboplatin(M2288)、Capecitabine(M1963)、Cisplatin (M2223)、Dabrafenib(M1988)、Dasatinib(M1701 )、Dibenzazepine(M3523)、Enzalutamide(M1839)、Fruquintinib(M7554)、Irinotecan(M4465 )。
腫瘤藥敏篩選（人源化單抗）：
Nivolumab(M6100)、Pembrolizumab(M6102)、Tremelimumab(M25253)、Bevacizumab (M6166)、Panitumumab(M1503)、Pertuzumab(M6221)。
*本文所述抑制劑/人源單抗均為科研試劑，僅供科學(xué)實(shí)驗(yàn)用途。
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