小鼠模型在揭示平滑肌細胞對主動脈疾病的起源依賴性易感性中的應用
該研究利用Cre-loxP和Dre-rox的雙同源重組酶，開發(fā)了系統(tǒng)性的交叉遺傳示蹤新技術(shù)，成功實現(xiàn)了對主動脈不同發(fā)育起源平滑肌細胞（SMCs）的精準譜系示蹤和遺傳靶向。這一成果不僅為探索來源依賴性或位置特異性主動脈血管相關(guān)疾病提供了新的技術(shù)，同時能夠全面分析不同發(fā)育起源的SMC細胞亞群對病理的影響，理解主動脈疾病的發(fā)病機制和開發(fā)針對性治療方法提供了新的平臺。
南模生物為該研究提供了Isl1-Dre（目錄號：NM-KI-200177）、Wnt1-Dre（目錄號：NM-KI-200176）、Upk3b-Dre（目錄號：NM-KI-200175）、Myh11-RSR-CreER、以及Myh11-CrexER小鼠模型。
主動脈瘤是一種主要的血管疾病，發(fā)病突然，死亡率高，對人類的生命和健康構(gòu)成嚴重威脅。SMCs是主動脈的主要細胞成分，它們不僅參與血管的收縮和舒張，還在維持血管結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮著重要作用。近年來，許多細胞譜系追蹤研究表明，不同血管或同一血管的不同段落由來自不同祖細胞的SMC群體組成，每種群體都有其獨特的譜系和發(fā)育歷史。例如，主動脈的升段和降段的SMCs可能來自不同的祖細胞。這種異質(zhì)性在血管系統(tǒng)中表現(xiàn)為一種鑲嵌模式，即在同一個動脈樹中存在不同的SMC亞型。SMCs之間的發(fā)育多樣性在細分特異性主動脈疾病中起著至關(guān)重要的作用。但是，傳統(tǒng)的遺傳方法不足以實現(xiàn)與細胞起源相關(guān)的疾病易感性的體內(nèi)分析。因此，研究者們迫切需要建立針對不同發(fā)育起源的遺傳技術(shù)，以研究主動脈疾病的機制。
首先，該研究工作分別利用了Isl1啟動子構(gòu)建了Isl1-Dre的工具小鼠用于標記第二心場（SHF）起源的所有細胞、利用Wnt1啟動子構(gòu)建了Wnt1-Dre的工具小鼠用于標記心臟神經(jīng)嵴（CNC）起源的所有細胞、利用Meox1啟動子構(gòu)建了Meox1-DreER的工具小鼠用于標記體節(jié)中胚層（Som）起源的所有細胞，以及利用Upk3b啟動子構(gòu)建了Upk3b-Dre的工具小鼠用于標記間皮（Mes）起源的所有細胞。
為實現(xiàn)對不同發(fā)育起源平滑肌細胞更特異性的遺傳靶向示蹤，研究人員進一步利用雙同源重組的交叉遺傳學示蹤技術(shù)，使Myh11-RSR-CreER與Myh11-CrexER工具小鼠結(jié)合以上四個靶向不同發(fā)育起源的Dre工具小鼠，將CreER或Cre的表達限定在Dre啟動子基因與Myh11基因同時表達的細胞中。用于定位升主動脈的SMCs工具鼠被命名為SHF-SMC-CreER，用于定位主動脈弓處的心臟神經(jīng)嵴起源的平滑肌細胞的小鼠模型被命名為CNC-SMC-CreER，用于定位體節(jié)的降主動脈上的平滑肌細胞的小鼠模型被命名為Som-SMC-CreER，用于定位發(fā)育起源來自間皮且定位于內(nèi)臟器官上的平滑肌細胞的小鼠模型被命名為Mes-SMC-CreER，通過靈活運用這四個小鼠模型工具，研究者們實現(xiàn)了對不同發(fā)育起源平滑肌細胞的特異性示蹤。
Fig.1 Generation and characterization of Myh11-RSR-CreER and Myh11-CrexER mice.
TGF-β信號通路對組織穩(wěn)態(tài)和疾病至關(guān)重要，在主動脈壁的結(jié)構(gòu)完整性和功能調(diào)控中也發(fā)揮的關(guān)鍵作用，影響著在動脈瘤發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用的細胞行為，被認為是導致SHF衍生細胞易患血管病變的原因之一。為了探究TGF-β信號通路在不同發(fā)育起源SMCs相關(guān)主動脈疾病中的作用，研究者們分別用SHF-SMC-CreER工具在第二心場起源的SMCs中敲除Tgfbr2基因。與對照組小鼠相比，實驗組小鼠升主動脈壁的穩(wěn)態(tài)被破壞，動脈瘤的形成加快。這些數(shù)據(jù)表明，SHF（第二心場）來源的平滑肌細胞（SMCs）中TGF-β信號通路對升主動脈瘤具有保護作用。
Smad4是TGF-β信號通路的核心調(diào)節(jié)器，SMAD蛋白作為下游效應分子，能夠?qū)GF-β信號傳遞至細胞核，調(diào)控目標基因的表達。使用CNC-SMC-Cre的遺傳靶向工具特異性的在心臟神經(jīng)嵴起源的SMCs中敲除Smad4基因后，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的實驗組小鼠中都觀察到主動脈瘤的表型。研究人員又通過單細胞測序技術(shù)對Smad4-CNC-SMCKO小鼠和Smad4-CNC-SMCCtrl對照組小鼠的主動脈弓和降主動脈分別進行了無偏差的轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)Smad4-CNC-SMCKO組小鼠的主動脈弓（AA）組與其他三個對照組之間存在明顯的細胞群體差異。研究者們在Smad4-CNC-SMCKO的AA實驗組中觀察到一群獨特的調(diào)節(jié)型SMCs群，出現(xiàn)典型SMCs標記物的表達降低，同未成熟標記物的表達增加。這些結(jié)果表明，主動脈弓中Smad4基因的敲除會導致SMCs向調(diào)節(jié)型細胞轉(zhuǎn)變，使其典型SMC表型減少，并呈現(xiàn)纖維肌細胞特征，可能與主動脈弓的病理變化密切相
關(guān)。
Fig.2 Genetation of origin-dependent SMC genetic tools using intersectional genetics.
隨著單細胞RNA測序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合本文所述的交叉遺傳學策略，可通過特異性標記物進一步研究異質(zhì)性細胞群體的功能，從而深化對復雜細胞群體的理解。本研究開發(fā)的雙重組酶介導交叉遺傳學方法，實現(xiàn)了對不同發(fā)育來源SMC的譜系追蹤和基因操作的精準靶向。該遺傳學系統(tǒng)不僅提高了實驗結(jié)果的準確性，還大幅降低了干擾數(shù)據(jù)解讀的混雜變量風險。這一精密的遺傳學策略將加速靶向治療的研發(fā)進程，有望推動主動脈疾病診療技術(shù)的革新。
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