摘要
探究丙型肝炎病毒（HCV）非結(jié)構(gòu)蛋白4B（NS4B）對(duì)宿主細(xì)胞基因表達(dá)的影響。通過構(gòu)建NS4B真核表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。結(jié)果顯示，NS4B顯著調(diào)控細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答及脂代謝相關(guān)通路。實(shí)驗(yàn)揭示了NS4B在HCV致病機(jī)制中的潛在作用，為抗病毒靶點(diǎn)開發(fā)提供了理論依據(jù)。
引言
丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球慢性肝病的主要病因之一，可導(dǎo)致肝硬化及肝癌。其非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B作為病毒復(fù)制復(fù)合體的核心組分，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的重塑，但NS4B對(duì)宿主細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。已有研究表明，NS4B可能通過干擾宿主信號(hào)通路促進(jìn)病毒持續(xù)感染，但其具體靶基因及功能網(wǎng)絡(luò)仍待解析。本研究通過轉(zhuǎn)染NS4B至肝源性細(xì)胞系，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)篩選差異表達(dá)基因，旨在闡明NS4B的宿主互作機(jī)制，為HCV治療策略提供新方向。
實(shí)驗(yàn)部分
1. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
細(xì)胞與載體：人肝癌細(xì)胞系Huh-7（某試劑培養(yǎng)），pcDNA3.1-NS4B真核表達(dá)載體（某試劑合成）。
主要儀器：威尼德電穿孔儀（轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化至75%）、威尼德紫外交聯(lián)儀（核酸固定）、威尼德分子雜交儀（Southern blot驗(yàn)證）。
2. 實(shí)驗(yàn)方法
（1）NS4B表達(dá)載體構(gòu)建與驗(yàn)證
通過PCR擴(kuò)增HCV NS4B編碼序列（基因型1b），克隆至pcDNA3.1載體。利用威尼德原位雜交儀進(jìn)行限制性酶切及連接反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤后，使用某試劑純化質(zhì)粒。
（2）細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組
將Huh-7細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NS4B）和對(duì)照組（空載體）。采用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓120 V，脈沖時(shí)長20 ms）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞。
（3）RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
使用某試劑提取總RNA，Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)RNA完整性（RIN≥8.0）。建庫后于Illumina NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序（讀長150 bp），數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后比對(duì)至人類參考基因組（GRCh38）。
（4）差異表達(dá)基因篩選與分析
通過DESeq2軟件（|log2FC|>1，p<0.05）篩選DEGs，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路富集分析。關(guān)鍵基因通過qRT-PCR驗(yàn)證（某試劑SYBR Green Mix）。
（5）蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，Cytoscape軟件可視化并篩選核心節(jié)點(diǎn)基因。
結(jié)果
1. NS4B轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞表型
威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染后，Western blot證實(shí)NS4B在Huh-7細(xì)胞中高效表達(dá)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速率下降20%（p<0.01），凋亡率增加35%。
2. 差異表達(dá)基因篩選
轉(zhuǎn)錄組分析共鑒定到682個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因412個(gè)（如CASP3、STAT1），下調(diào)基因270個(gè)（如PPARG、FASN）。
3. 功能富集與通路分析
GO分析表明，DEGs主要參與“凋亡信號(hào)調(diào)控”（p=3.2×10^-5）和“先天免疫應(yīng)答”（p=1.8×10^-4）。KEGG通路中，“丙型肝炎感染通路”（p=0.002）和“PPAR信號(hào)通路”（p=0.005）顯著富集。
4. 核心基因驗(yàn)證
qRT-PCR證實(shí)CASP3、STAT1表達(dá)上調(diào)2.5倍（p<0.001），PPARG下調(diào)1.8倍（p<0.01），與測(cè)序結(jié)果一致。
討論
NS4B通過調(diào)控宿主基因表達(dá)介導(dǎo)HCV致病性已被多項(xiàng)研究推測(cè)，但本研究首次系統(tǒng)揭示其靶向脂代謝與免疫相關(guān)通路的分子機(jī)制。CASP3與STAT1的上調(diào)提示NS4B可能通過激活凋亡及干擾素信號(hào)促進(jìn)肝細(xì)胞損傷，而PPARG的下調(diào)或?qū)е轮�代謝紊亂，與HCV感染后脂肪變性表型吻合。此外，蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中的核心基因（如JUN、MAPK1）為后續(xù)功能研究提供了重點(diǎn)方向。
結(jié)論
本研究證實(shí)HCV NS4B通過調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡、免疫及脂代謝相關(guān)基因表達(dá)，參與病毒致病過程。篩選的核心基因及通路為開發(fā)靶向NS4B的抗病毒策略提供了重要依據(jù)。后續(xù)研究將聚焦于NS4B與宿主因子的直接互作機(jī)制。
 參考文獻(xiàn)
1. 應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因[J].劉妍;成軍;王剛;李克;段惠娟;李莉,解放軍醫(yī)學(xué)雜志.2001,第12期
2. 基因芯片技術(shù)在肝炎病毒研究中的應(yīng)用[J].劉妍;成軍;王建軍;楊倩;陸蔭英,世界華人消化雜志.2003,第4期
3. 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究[J].劉妍;陸蔭英;成軍;王建軍;李莉;張玲霞,解放軍醫(yī)學(xué)雜志.2003,第1期
4. 丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS3反式激活SV40病毒早期啟動(dòng)子的研究[J].劉妍;成軍;牟勁松;陸蔭英;王建軍;李克;王琳;張玲霞,解放軍醫(yī)學(xué)雜志.2003,第1期
5. A novel human protease similar to the interleukin-1 beta converting enzyme induces apoptosis in transfected cells.[J].Aldape RA;Blanchet AM;Lippke JA;Miossec C;Gu Y;Faucheu C;Diu A;Collard Dutilleul V;Chan AW;al.;Herve F,The EMBO Journal.1995,第9期
6. DEDD and DEDD2 associate with caspase-8/10 and signal cell death.[J].Tang J;Alcivar A;Hu S;Yang X,Oncogene.2003,第2期
7. DEDD, a novel death effector domain-containing protein, targeted to the nucleolus.[J].Stegh AH;Schickling O;Ehret A;Scaffidi C;Peterhansel C;Hofmann TG;Grummt I;Krammer PH;Peter ME,EMBO Journal.1998,第20期