核基因組突變是多種疾病的根源，而線(xiàn)粒體作為細(xì)胞內(nèi)具有半自主功能的細(xì)胞器，擁有獨(dú)立的基因組，其基因組突變同樣與多種遺傳疾病密切相關(guān)。線(xiàn)粒體疾病通常累及多種組織器官，其中最為人熟知的包括Leigh綜合征和LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）。Leigh綜合征的癥狀包括發(fā)育遲緩、肌張力減退、運(yùn)動(dòng)和呼吸障礙等，而LHON則表現(xiàn)為視力喪失、中央暗點(diǎn)和視神經(jīng)萎縮等問(wèn)題。根據(jù)MITOMAP的統(tǒng)計(jì)，目前已驗(yàn)證的線(xiàn)粒體致病性突變有97個(gè)，其中點(diǎn)突變占比高達(dá)95%。然而，由于缺乏有效的點(diǎn)突變相關(guān)線(xiàn)粒體疾病小鼠模型，線(xiàn)粒體疾病的研究與治療開(kāi)發(fā)受到了嚴(yán)重制約。

早期的小鼠模型主要通過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)或遺傳工程構(gòu)建[1]，但這些方法操作復(fù)雜、成本高昂且對(duì)突變的精準(zhǔn)控制較差，僅成功建立了極少數(shù)模型。近年來(lái)，研究人員成功開(kāi)發(fā)了線(xiàn)粒體堿基編輯工具，可以對(duì)線(xiàn)粒體DNA實(shí)現(xiàn)C到T和A到G的編輯，例如DdCBEs和TALEDs。這些工具基于雙鏈DNA脫氨酶DddA蛋白[2, 3]。雖然已有研究者嘗試將這些工具應(yīng)用于小鼠模型的構(gòu)建，但其編輯效率尚不足以模擬人類(lèi)線(xiàn)粒體疾病中高突變負(fù)荷的特征[4, 5]。此外，研究表明DdCBEs可能引發(fā)大量核基因組脫靶效應(yīng)，這種非TALE依賴(lài)性的脫靶主要源于DddA蛋白的自組裝以及其與CTCF的相互作用[6]。因此，基于DddA的線(xiàn)粒體堿基編輯工具在應(yīng)用中面臨核基因組脫靶的風(fēng)險(xiǎn)，難以直接建立線(xiàn)粒體突變與疾病表型之間的因果聯(lián)系。
 

圖片來(lái)源：《Nature》
（https://www.nature.com/articles/s41586-024-08469-8）

針對(duì)這一挑戰(zhàn)，昌平實(shí)驗(yàn)室/北京大學(xué)魏文勝課題組此前開(kāi)發(fā)了mitoBEs，這是一種結(jié)合切口酶與單鏈DNA脫氨酶的新型線(xiàn)粒體堿基編輯工具，能夠?qū)崿F(xiàn)線(xiàn)粒體DNA的C到T和A到G編輯。與DdCBEs和TALEDs相比，mitoBEs展現(xiàn)出卓越的鏈特異性和顯著降低的脫靶效應(yīng)。得益于其雙向堿基編輯能力，mitoBEs能夠?qū)Υ蠹s87%的致病線(xiàn)粒體突變進(jìn)行精確建模[7]。

2025年1月22日，昌平實(shí)驗(yàn)室/北京大學(xué)魏文勝課題組在Nature雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為“Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs”的研究論文。該研究報(bào)道了通過(guò)優(yōu)化后的mitoBEs實(shí)現(xiàn)高效且精準(zhǔn)地構(gòu)建線(xiàn)粒體疾病小鼠模型的成果。利用優(yōu)化版mitoBEs，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了具有高突變頻率的小鼠模型，這些模型表現(xiàn)出了與疾病相關(guān)的典型表型。此外，通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)，還獲得了突變負(fù)荷達(dá)到100%以及僅含單堿基突變的精確小鼠模型。

作者在賽業(yè)生物進(jìn)行了全面的小鼠模型研究，包括RNA受精卵注射、小鼠繁育（飼養(yǎng)配繁、PCR及測(cè)序鑒定），以及多方面的下游表型檢測(cè)。這些檢測(cè)涵蓋了血生化（CRE和BUN）、尿生化（CRE、mALB和UTP）分析、視網(wǎng)膜電圖（ERG）評(píng)估，還有行為學(xué)測(cè)試如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和抓力實(shí)驗(yàn)，以綜合評(píng)價(jià)小鼠的生理和行為特征。

為準(zhǔn)確建立突變與疾病表型之間的直接聯(lián)系，消除堿基編輯工具的脫靶效應(yīng)尤為重要。在利用mitoBEs進(jìn)行建模時(shí)，需要將RNA編碼的mitoBEs注射到小鼠受精卵中。因此，該研究首先對(duì)RNA編碼的mitoBEs系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了全面評(píng)估。結(jié)果表明，RNA編碼的mitoABE存在廣泛的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應(yīng)，而mitoCBE則表現(xiàn)出一定程度的依賴(lài)于APOBEC1蛋白的線(xiàn)粒體基因組脫靶效應(yīng)。為了提高mitoBEs的精準(zhǔn)性，該研究重點(diǎn)優(yōu)化了脫氨酶。針對(duì)mitoABE，通過(guò)突變篩選發(fā)現(xiàn)，TadA8e-V106W-V28F能夠顯著降低轉(zhuǎn)錄組脫靶至背景水平（圖1）。針對(duì)mitoCBE，篩選了多種現(xiàn)有的胞嘧啶脫氨酶，并發(fā)現(xiàn)TadA衍生的胞嘧啶脫氨酶CBE6d在線(xiàn)粒體基因組上表現(xiàn)出的脫靶效應(yīng)接近背景水平�；�于這些優(yōu)化成果，研究團(tuán)隊(duì)將改進(jìn)后的mitoBEs命名為mitoBEs v2，包括mitoABE v2和mitoCBE v2（圖1）。此外，該研究還系統(tǒng)性地評(píng)估了優(yōu)化前后mitoBEs在核基因組上的脫靶效應(yīng)，結(jié)果顯示，無(wú)論是優(yōu)化前還是優(yōu)化后的mitoBEs，均未在核基因組上引發(fā)明顯的脫靶效應(yīng)，從而驗(yàn)證了其在基因編輯中的安全性和可靠性。

圖1 對(duì)mitoBEs的精準(zhǔn)性進(jìn)行優(yōu)化[8]

通過(guò)將85個(gè)人類(lèi)致病性線(xiàn)粒體DNA點(diǎn)突變與小鼠線(xiàn)粒體基因組進(jìn)行同源性比對(duì)，研究確定了70個(gè)可編輯位點(diǎn)。進(jìn)一步的細(xì)胞水平初步篩選成功實(shí)現(xiàn)了其中68個(gè)位點(diǎn)的編輯。比較發(fā)現(xiàn)，由環(huán)狀RNA（circRNA）編碼的mitoBEs v2相比于mRNA編碼的工具，具有更高的編輯效率。因此，研究團(tuán)隊(duì)將circRNA編碼的mitoBEs v2注射至小鼠胚胎并進(jìn)行移植，結(jié)果顯示mitoBEs v2在多種F0代小鼠模型中均實(shí)現(xiàn)了較高的編輯效率，其中mt-Nd5 A12784G F0小鼠模型的突變頻率高達(dá)82%（圖2）。此外，該研究系統(tǒng)性評(píng)估了F0代小鼠在線(xiàn)粒體基因組和核基因組中的脫靶效應(yīng)，結(jié)果表明，在整個(gè)基因組范圍內(nèi)未檢測(cè)到脫靶效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)表明，mitoBEs v2能夠構(gòu)建遺傳背景干凈的線(xiàn)粒體疾病小鼠模型。更重要的是，線(xiàn)粒體基因組的編輯結(jié)果在小鼠不同組織中表現(xiàn)出廣泛且持久的存在（圖2），并且能夠通過(guò)母系遺傳穩(wěn)定傳遞。通過(guò)進(jìn)一步雜交實(shí)驗(yàn)，研究成功獲得了目標(biāo)位點(diǎn)編輯效率達(dá)到100%以及僅含目標(biāo)位點(diǎn)突變的mt-Nd5 A12784G小鼠模型。
 

圖2 mitoBEs v2實(shí)現(xiàn)高效線(xiàn)粒體疾病小鼠模型建立并且編輯結(jié)果廣泛持久存在于各個(gè)組織[8]

mt-Atp6 T8591C和mt-Nd5 A12784G分別對(duì)應(yīng)人類(lèi)線(xiàn)粒體致病突變m.T9191C和m.A13379G，并分別導(dǎo)致Leigh綜合征和LHON。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)突變率較高的F0代小鼠進(jìn)行了疾病表型評(píng)估，結(jié)果顯示，mt-Atp6 T8591C小鼠表現(xiàn)出顯著的心臟功能障礙，與Leigh綜合征的臨床特征相符；mt-Nd5 A12784G小鼠則表現(xiàn)出類(lèi)似LHON的視力障礙（圖3）。此外，研究還通過(guò)調(diào)整TALE結(jié)合位點(diǎn)，成功構(gòu)建了僅含目標(biāo)位點(diǎn)編輯的單堿基突變mt-Nd5 A12784G小鼠模型。這些研究結(jié)果充分證明了mitoBE v2在創(chuàng)建線(xiàn)粒體疾病小鼠模型方面的高效性和精準(zhǔn)性，為深入探索線(xiàn)粒體疾病的致病機(jī)制及開(kāi)發(fā)新型治療策略提供了重要工具。
 

圖3 小鼠模型表現(xiàn)對(duì)應(yīng)的疾病表型[8]

北京大學(xué)博士后伊宗裔為該論文的共同通訊作者，昌平實(shí)驗(yàn)室博士后張小雪為論文的第一作者，張雪、任紀(jì)武、李佳怡、魏曉旭和于瑩博士也為該研究做出了重要貢獻(xiàn)。本研究得到了昌平實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家自然科學(xué)基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心及中國(guó)博士后科學(xué)基金的資助。

文獻(xiàn)原文
Zhang, X., Zhang, X., Ren, J. et al. Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08469-8

參考文獻(xiàn)
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5.Cho, S.I., et al., Engineering TALE-linked deaminases to facilitate precision adenine base editing in mitochondrial DNA. Cell, 2024. 187(1).
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7.Yi, Z.Y., et al., Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs. Nature Biotechnology, 2024. 42(3).
8.Zhang, X., Zhang, X., Ren, J. et al. Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08469-8