引言
       SARS（嚴重急性呼吸綜合征）冠狀病毒是一種高傳染性的病原體，自2002年底首次爆發(fā)以來，對全球公共衛(wèi)生構成了嚴重威脅。SARS-CoV的S蛋白不僅是病毒的主要結構蛋白，還在病毒與宿主細胞表面受體結合及介導膜融合進入細胞的過程中起關鍵性作用。因此，S蛋白成為SARS疫苗研究的主要靶點。裂殖酵母作為一種非常有前景的外源基因表達系統(tǒng)，表達的外源蛋白更接近其天然特性，是分子生物學研究中的重要工具。本研究旨在構建SARS-CoV S蛋白在裂殖酵母中的表達體系，為進一步研究新一代SARS疫苗提供材料。

材料與方法

1. 材料：
   • 菌株：裂殖酵母菌株TCP1（亮氨酸營養(yǎng)缺陷型），購自某生物科技公司。
   • 載體：裂殖酵母表達載體pNMT1，由本實驗室保存。
   • 試劑：某品牌PCR試劑、某品牌DNA連接酶、某品牌DNA電泳試劑、某品牌SDS-PAGE試劑、某品牌Western blot試劑等。
   • 儀器：威尼德電穿孔儀、某品牌離心機、某品牌PCR儀、某品牌電泳儀、某品牌分光光度計等。
2. 方法：
   • S蛋白基因擴增：根據(jù)SARS-CoV S蛋白主要抗原表位的分析，從含S基因全長的質粒上PCR擴增出五個片段，分別位于S基因的43～903、808～1674、1591～2538、2440～3399、2734～3588位置。
   • 載體構建：將擴增的五個片段分別克隆到裂殖酵母載體pNMT1中，構建重組載體pNMT1.Sn（n=1,2,3,4,5）。
   • 電穿孔轉化：使用威尼德電穿孔儀將重組載體轉化到TCP1菌株中，得到誘導表達五個片段的裂殖酵母菌株。
   • 誘導表達：在適當?shù)臈l件下，用去硫胺誘導重組裂殖酵母菌株表達S蛋白片段。
   • 蛋白檢測：使用SDS-PAGE和Western blot分析誘導表達產(chǎn)物，檢測S蛋白片段的表達情況。

實驗結果

1. 重組載體構建：
          成功將五個S蛋白片段克隆到裂殖酵母載體pNMT1中，構建了五個重組載體pNMT1.Sn（n=1,2,3,4,5）。通過PCR和測序驗證，確認重組載體構建正確。

2. 誘導表達：
          將重組裂殖酵母菌株在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)，并用去硫胺誘導表達S蛋白片段。通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)五個片段在裂殖酵母中得到不同程度的表達。其中，S1和S5片段在約30kD處有明顯表達，S2片段大小為約34kD，S3和S4片段大小為約39kD。Western blot進一步證實了這些片段的表達，最高表達量占總酵母蛋白的10%以上。

3. 表達量優(yōu)化：
          誘導時間對S蛋白片段的表達量有一定影響。實驗發(fā)現(xiàn)，當去硫胺誘導16小時時，表達量達到最高，誘導時間延長表達量反而降低。

討論

1. 構建轉化體系的意義：
          本研究成功構建了SARS-CoV S蛋白在裂殖酵母中的表達體系，實現(xiàn)了S蛋白片段的高效表達。這不僅為SARS疫苗的研究提供了新材料，還為其他冠狀病毒蛋白的表達提供了參考。裂殖酵母作為一種真核表達系統(tǒng)，具有許多與高等真核生物相似的性質，表達的外源蛋白更接近其天然特性，因此在疫苗研究和生物制藥領域具有廣闊的應用前景。

2. 實驗結果分析：
          SDS-PAGE和Western blot結果表明，五個S蛋白片段在裂殖酵母中得到不同程度的表達。其中，S1和S5片段的表達量較高，而S2、S3和S4片段的表達量相對較低。這可能與片段的大小、結構和在裂殖酵母中的穩(wěn)定性有關。進一步的研究可以通過優(yōu)化表達條件、改進載體設計等方法來提高這些片段的表達量。

3. 研究創(chuàng)新：
          本研究首次將SARS-CoV S蛋白片段在裂殖酵母中表達，并成功獲得了具有生物學活性的重組蛋白。這不僅為SARS疫苗的研究提供了新的思路和方法，還為其他冠狀病毒蛋白的表達和純化提供了借鑒。此外，本研究還優(yōu)化了誘導表達條件，提高了S蛋白片段的表達量，為后續(xù)的研究奠定了基礎。

4. 應用前景：
          裂殖酵母表達的SARS-CoV S蛋白片段具有廣泛的應用前景。首先，這些片段可以作為SARS疫苗研究的候選抗原，用于誘導中和抗體的產(chǎn)生。其次，這些片段還可以用于SARS病毒與宿主細胞相互作用的研究，揭示病毒感染的分子機制。此外，裂殖酵母表達系統(tǒng)還可以用于其他冠狀病毒蛋白的表達和純化，為冠狀病毒的研究和防治提供有力支持。

結論

       本研究成功構建了SARS-CoV S蛋白在裂殖酵母中的表達體系，并實現(xiàn)了五個片段的高效表達。SDS-PAGE和Western blot結果表明，這些片段在裂殖酵母中得到不同程度的表達，為SARS疫苗的研究提供了新材料。進一步的研究將優(yōu)化表達條件、提高表達量，并探索這些片段在疫苗研究和病毒防治中的應用潛力。裂殖酵母作為一種真核表達系統(tǒng)，在SARS-CoV S蛋白的表達和純化方面具有廣闊的應用前景，為冠狀病毒的研究和防治提供了新的思路和方法。