畢赤酵母（Pichia pastoris，P. pastoris）作為工業(yè)應(yīng)用蛋白質(zhì)生產(chǎn)最為常見酵母物種之一，已被成功應(yīng)用于1000多種外源蛋白質(zhì)的表達^[1]。目前發(fā)酵過程中測定菌體生長主要采用OD600、干濕稱量法等無法精確的反應(yīng)酵母的具體細(xì)胞數(shù)目，傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)則需要36h的培養(yǎng)時間^[2-3]。本文采用CytScop^®mini設(shè)備針對畢赤酵母進行參數(shù)優(yōu)化，提供快速、準(zhǔn)確的畢赤酵母AOPI計數(shù)新方案。
測試樣本及儀器設(shè)置參數(shù)

• 畢赤酵母：母液濃度約20×10⁶ cells/mL。
• 畢赤酵母儀器測試參數(shù)
• 細(xì)胞類型名稱：AOPI-畢赤酵母
• 畢赤酵母樣本儀器測試參數(shù)

稀釋及取樣
按照ISO6887-1:2017提供的倍比稀釋指南，對樣本母液進行連續(xù)稀釋，得到6個稀釋梯度：1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125，每個濃度梯度取3個平行，上機測試。
計數(shù)結(jié)果分析
變異系數(shù)（C.V）是衡量各觀測值變異程度的一個統(tǒng)計量，常常用來反映一組數(shù)據(jù)的離散程度，在儀器的測量中可以用來反映儀器測量的精確性。C.V值越小，說明儀器測試數(shù)據(jù)離散程度越小，儀器的重復(fù)性越好，精確度越高。如下表1所示，畢赤酵母樣品測試數(shù)據(jù)的C.V均值為3.47%。
表1 畢赤酵母實驗原始數(shù)據(jù)及計算結(jié)果  
比例指數(shù)（PI）（引自ISO 20391-2）是用來量化細(xì)胞計數(shù)方法符合比例原則的程度，偏離比例性的情況說明測量存在系統(tǒng)性或非系統(tǒng)性誤差，從而導(dǎo)致測量精度損失。PI值越小，說明儀器測試越接近比例原則，儀器精確度越高。如表1所示，本次細(xì)胞測試的PI為0.714。
對畢赤酵母結(jié)果進行線性擬合分析，結(jié)果如圖2所示。   如圖3所示，在不同濃度下畢赤酵母都有較好的熒光成像效果。  
如圖4所示，畢赤酵母不同稀釋梯度下能很好的被CytScop®mini識別標(biāo)記，畢赤酵母具有高識別率。
對各稀釋濃度活率進行統(tǒng)計計算，結(jié)果如圖5所示。 結(jié)論
為驗證CytScop^®mini對畢赤酵母AOPI染色下計數(shù)的精確度和準(zhǔn)確度采用倍比稀釋法進行測試。
在不同畢赤酵母稀釋比例下均有較低熒光背景和清晰的細(xì)胞熒光，明場標(biāo)記圖像有良好的細(xì)胞識別率。
倍比稀釋結(jié)果顯示，6組不同稀釋比例C.V均<10%，平均C.V=3.47%，線性回歸R²=0.995，PI=0.714，體現(xiàn)了CytScop^®mini采用AOPI染色對畢赤酵母計數(shù)有良好的準(zhǔn)確度和精密度。
綜上，通過采用AOPI對畢赤酵母染色，在0.8-20M密度范圍計數(shù)有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

參考文獻
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