聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)體系各組份對實驗的影響
PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成，各個組份對PCR結(jié)果至關(guān)重要。
1. 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶試劑盒供應(yīng)。
標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響；濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200 μM時，Mg2+為1.5 mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度，在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好（僅供參考）。
2. dNTP ：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400 μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于 其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3. Taq DNA聚合酶：在100μL反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4. 引物：引物是擴(kuò)增PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：
（1）引物的長度以15-30 bp為宜，通常設(shè)計長度為17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；兩條引物的Tm值應(yīng)盡量接近，可以采用專用軟件來計算（Primer Premier 5）；盡量避免A/G或T/C的連續(xù)排列，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端），堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。
（2）互補性，引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3個堿基以上的互補序列，引物末端避免2base以上的互補序列。引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基（最好是G或C，避免為T）在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。
（3）引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μL較好。
（4）引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。
5．模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR模板。雖然 PCR 可以微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA）作為模板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或 拷貝數(shù)較高的待擴(kuò)增片段作為起始模板。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。
6. PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間，可增加產(chǎn)物的特異性。
注意事項：
1.PCR應(yīng)該在沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，最好設(shè)立一個專用的PCR配制室、模板室、擴(kuò)增室，避免污染（16S）。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染，操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高溫高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性與平行性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用滅菌的tubes和tips，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR配制試劑應(yīng)在冰上融化，并且要瞬離并充分混勻。
PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成，各個組份對PCR結(jié)果至關(guān)重要。
1. 反應(yīng)緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶試劑盒供應(yīng)。
標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響；濃度過高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過低，使產(chǎn)物減少。在各種單核苷酸濃度為200 μM時，Mg2+為1.5 mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度，在高濃度DNA及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好（僅供參考）。
2. dNTP ：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯誤摻入，過高則可能不擴(kuò)增；但濃度過低，將降低反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400 μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應(yīng)相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于 其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發(fā)聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。
3. Taq DNA聚合酶：在100μL反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗或使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應(yīng)效率將降低。
4. 引物：引物是擴(kuò)增PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：
（1）引物的長度以15-30 bp為宜，通常設(shè)計長度為17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；兩條引物的Tm值應(yīng)盡量接近，可以采用專用軟件來計算（Primer Premier 5）；盡量避免A/G或T/C的連續(xù)排列，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端），堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機(jī)的。
（2）互補性，引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3個堿基以上的互補序列，引物末端避免2base以上的互補序列。引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基（最好是G或C，避免為T）在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。
（3）引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μL較好。
（4）引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。
5．模板：PCR對模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR模板。雖然 PCR 可以微量的樣品（甚至是來自單一細(xì)胞的DNA）作為模板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜用μg水平的基因組DNA或 拷貝數(shù)較高的待擴(kuò)增片段作為起始模板。原材料可以是粗制品，某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。
6. PCR循環(huán)加快，即相對減少變性、復(fù)性、延伸的時間，可增加產(chǎn)物的特異性。
注意事項：
1.PCR應(yīng)該在沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行，最好設(shè)立一個專用的PCR配制室、模板室、擴(kuò)增室，避免污染（16S）。
2.純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染，操作過程中均應(yīng)戴手套。
4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高溫高壓滅菌。
5.試劑都應(yīng)該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性與平行性。
6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用滅菌的tubes和tips，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
7.PCR配制試劑應(yīng)在冰上融化，并且要瞬離并充分混勻。
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