鐵，是維持人體正常生理功能所必需的微量金屬營養(yǎng)元素。例如，在氧氣運(yùn)輸、呼吸鏈電子傳遞、氧化還原平衡、大分子生物合成等方面，鐵起到至關(guān)重要的作用。鐵代謝失衡會引發(fā)多種免疫相關(guān)疾病，例如：鐵缺失會導(dǎo)致B細(xì)胞細(xì)胞周期停滯并引發(fā)B細(xì)胞譜系發(fā)育受阻；鐵超載則會促進(jìn)CD4+T細(xì)胞病理性擴(kuò)增，引發(fā)紅斑狼瘡的自身免疫表型。癌癥本身也是異常增殖細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，免受免疫細(xì)胞殺傷和清除的綜合性疾病。然而，鐵元素，特別是鐵代謝，在癌癥發(fā)生和惡性進(jìn)展中起到何種作用，在腫瘤微環(huán)境中如何調(diào)控抗腫瘤免疫，這些科學(xué)問題仍然知之甚少。

最近，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院朱鶴研究員團(tuán)隊(duì)，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌微環(huán)境中存在一群鐵富集的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，根據(jù)英文縮寫(Ferrum iron CAFs)作者將其命名為FerroCAF。FerroCAF在PCa中的比例隨疾病進(jìn)展而升高，并通過鐵依賴的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，促進(jìn)PCa腫瘤免疫抑制。該項(xiàng)研究是繼成肌纖維型CAF（myCAF）、免疫調(diào)節(jié)型CAF（iCAF）、抗原遞呈型CAF（apCAF）、衰老型CAF（senCAF）等相繼被報(bào)道后，我國學(xué)者揭示的促癌CAF新亞型：FerroCAF。
 

《Nature Communications》

研究材料和方法
作者利用單細(xì)胞測序技術(shù)（scRNA-seq）、多種前列腺癌(prostate cancer, PCa)轉(zhuǎn)基因小鼠模型、前列腺癌臨床組織樣本，普魯士藍(lán)鐵染色、連續(xù)切片免疫組化和免疫熒光染色、Ferro-Orange胞內(nèi)鐵探針流式檢測技術(shù)，揭示了鐵富集的CAF在包括前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中普遍存在。值得一提的是：作者在驗(yàn)證FerroCAF通過分泌髓系細(xì)胞相關(guān)分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等募集髓系來源抑制性細(xì)胞MDSC、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM等，促進(jìn)腫瘤免疫抑制的研究中，使用了賽業(yè)生物（Cyagen）的C-NKG免疫缺陷型小鼠，并闡明了FerroCAFs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)依賴于免疫細(xì)胞的功能。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 新型鐵富集CAF在前列腺癌中隨疾病進(jìn)展而富集

圖1 新型鐵富集CAF在前列腺癌中隨疾病進(jìn)展而富集

作者利用scRNA-seq技術(shù)對感興趣的CAF組分進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)Cluster-1是唯一一群既隨著腫瘤進(jìn)展（從3月到12月）比例上升，且在兩個時(shí)間點(diǎn)，占CAF中比例最高的亞群。KEGG分析揭示，Cluster-1有“元素吸收”和“鐵死亡”兩個關(guān)鍵特征。由于Cluster-1比例隨著腫瘤生長而升高，并未發(fā)生鐵死亡，作者進(jìn)而從鐵代謝的方向入手，通過普魯士藍(lán)鐵染色實(shí)驗(yàn)，揭示了在腫瘤組織的基質(zhì)區(qū)域存在一群鐵富集的stromal cell。在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中，作者利用連續(xù)組織切片，發(fā)現(xiàn)這群鐵富集的stromal cell表達(dá)CAF標(biāo)志物：PDPN，αSMA，PDGFR，S100A4，Vimentin等，同時(shí)不表達(dá)上皮Cd326/EpCam，不表達(dá)內(nèi)皮Cd31，不表達(dá)免疫Cd45等譜系標(biāo)記物，因此作者將其命名為鐵富集的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞FerroCAF。

2. FerroCAF的特異性標(biāo)記物為Pvr，且分泌MASP細(xì)胞因子和炎性因子

 
圖2 FerroCAF的特異性標(biāo)記物為Pvr，且分泌MASP細(xì)胞因子和炎性因子

作者利用scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)Cluster-1 FerroCAF特異性高表Pvr (poliovirus receptor), 進(jìn)而用免疫熒光染色等方法驗(yàn)證了Pvr是FerroCAF可靠的特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物，并且在小鼠和人類前列腺癌FerroCAF中具有種屬保守型。在FerroCAF排名靠前的差異表達(dá)基因中，絕大部分是髓系來源抑制性細(xì)胞（Myeloid Derived Suppressor Cell, MDSC）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor Associated Macrophage, TAM）相關(guān)的細(xì)胞因子和炎性因子，作者將其定義為MASP，包括CSF1，CCL2，CCL7，CXCL1，CXCL2等。這提示FerroCAFs可能通過MASP招募MDSC和TAM在腫瘤微環(huán)境中大量聚集。作者利用CellChat分析、條件性培養(yǎng)基刺激等實(shí)驗(yàn)闡明FerroCAFs和MDSC存在很強(qiáng)的“細(xì)胞-細(xì)胞通訊”活性，促進(jìn)髓系細(xì)胞高表達(dá)Arg1, Il10，Tgfb等免疫抑制性因子。

3. FerroCAF鐵富集是由Hmox1高表達(dá)催化Heme降解釋放游離鐵導(dǎo)致

 
圖3 FerroCAF鐵富集是由Hmox1高表達(dá)催化Heme降解釋放游離鐵導(dǎo)致

作者進(jìn)而探究了導(dǎo)致FerroCAF鐵富集表型的產(chǎn)生機(jī)制，研究者發(fā)現(xiàn)FerroCAF和其他CAF亞型相比，鐵攝取、鐵外排、鐵儲存等相關(guān)基因均無顯著差異。有趣的是，和鐵代謝密切相關(guān)的血紅素加氧酶Hmox1在FerroCAF中高表達(dá)，Hmox1的經(jīng)典生物學(xué)功能在于催化Heme降解，并釋放游離鐵Fe2+導(dǎo)致鐵富集。作者為了驗(yàn)證該假說，利用Hmox1抑制劑（Zn-PP, iHmox1）和Hmox1敲低等方法，發(fā)現(xiàn)抑制或下調(diào)Hmox1之后，F(xiàn)erroCAF中鐵含量顯著下降，并且MASP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也受到顯著抑制。

4. Hmox1抑制劑能顯著抑制MDSC和TAM募集，并促進(jìn)T細(xì)胞浸潤和抗腫瘤免疫
 

 
圖4 Hmox1抑制劑顯著抑制MDSC和TAM募集，并促進(jìn)T細(xì)胞浸潤

作者接著利用同種移植實(shí)驗(yàn)將FerroCAF和小鼠PCa細(xì)胞混合后，使用了C-NKG免疫缺陷型小鼠（由賽業(yè)生物提供）對C57BL/6小鼠（雄性）進(jìn)行前列腺原位同種移植實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分組后，一組用Hmox1抑制劑Zn-PP（iHmox1）進(jìn)行給藥，另一組則用vehicle作為對照處理。作者在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)比較了上述兩組小鼠的腫瘤大小、質(zhì)量、增殖等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)Hmox1抑制劑能顯著抑制原位前列腺癌腫瘤生長。作者進(jìn)而利用流式細(xì)胞術(shù)分析了腫瘤內(nèi)MDSC、TAM、T細(xì)胞等浸潤情況。盡管Hmox1抑制劑并未影響總體免疫細(xì)胞浸潤，但深刻改變了瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的組分：MDSC（包括PMN-MDSC和M-MDSC）和促癌型M2-TAM的數(shù)量均顯著下調(diào)；而抑癌型M1-TAM和Cd8+ T細(xì)胞的數(shù)量則顯著增加。Hmox1抑制劑也促進(jìn)了T細(xì)胞殺傷性相關(guān)基因如Gzmb、Ifng等表達(dá)。

5. FerroCAF中鐵富集激活Kdm6b介導(dǎo)的表觀遺傳重編程啟動MASP轉(zhuǎn)錄
 

 
圖5 FerroCAF鐵富集激活Kdm6b介導(dǎo)的表觀遺傳重編程啟動MASP轉(zhuǎn)錄表達(dá)

作者進(jìn)而探索鐵富集的表型如何介導(dǎo)MASP的表達(dá)。由于CAF和cancer cell相比，其genetic層面的突變相對較少，其促癌功能的獲得更多是由于epigenetic層面改變導(dǎo)致�；�于此，作者設(shè)想鐵富集可能激活了鐵依賴的表觀遺傳學(xué)酶功能。為了驗(yàn)證該假說，作者檢測FerroCAF中高表達(dá)的鐵依賴的表觀遺傳因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶Kdm6b（催化H3K27me3去甲基化修飾）在FerroCAFs中顯著性上調(diào)。生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Kdm6b在FerroCAF中表達(dá)上調(diào)，以及H3K27me3修飾在FerroCAFs中水平下調(diào)。作者還利用CUT&Tag實(shí)驗(yàn)揭示，在Hmox1敲除后(Hmox1-KO)的FerroCAF中，和對照相比，anti-H3K27me3 antibody和DNA結(jié)合明顯增強(qiáng)，在MASP相關(guān)的gene locus，H3K27me3的mark也顯著上調(diào)。這提示：從Hmox1/iron/Kdm6b信號軸上游敲除Hmox1，能誘發(fā)下游Kdm6b活性被抑制，導(dǎo)致MASP基因在內(nèi)的全基因組H3K27me3修飾增強(qiáng)，導(dǎo)致MASP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄抑制。

6. FerroCAF在前列腺癌中富集程度預(yù)示較差的臨床預(yù)后

 
圖6 FerroCAF在前列腺腫瘤中的富集程度預(yù)示著較差的臨床預(yù)后

最后作者利用已發(fā)表的臨床PCa的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)等，將FerroCAF的特征性基因（signature genes）：HMOX1、KDM6B、PVR、IL6、CCL2、CSF1、CXCL1等合并為一個基因集，命名為FerroScore用來反映FerroCAF的富集程度。結(jié)果顯示：作者不僅在其他發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)中找到了FerroCAF亞型的存在，也通過生信分析等手段揭示了FerroCAF的富集預(yù)示較高的免疫抑制性特征和較短的患者生存期。研究人員還檢測了FerroCAF在其他類型癌癥中的存在和臨床相關(guān)性。令人意外的是，作者通過增強(qiáng)型普魯士藍(lán)鐵染色、生信分析等方法，揭示FerroCAF在臨床肺癌樣本、卵巢癌樣本中均存在HMOX1高表達(dá)、鐵富集的FerroCAF。和前列腺癌類似，肺癌、卵巢癌中FerroCAF的富集程度中也預(yù)示著較高的免疫抑制性特征和較短的生存期。這提示FerroCAF在多種人類惡性腫瘤中廣泛存在，也預(yù)示通過阻斷Hmox1/iron/Kdm6b信號，抑制FerroCAF活性，能激活抗腫瘤免疫活性的廣譜可適性。

圖7 阻斷Hmox1/iron/Kdm6b信號，抑制FerroCAF活性，進(jìn)而激活抗腫瘤免疫在多種癌癥中具有廣譜可適性

實(shí)驗(yàn)結(jié)論
作者在前列腺癌微環(huán)境中揭示了一群未被報(bào)道的“鐵富集的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（FerroCAF）”，利用生信分析、生化、細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)闡明了FerroCAF中鐵富集表型是由血紅素加氧酶Heme Oxygenase 1 (Hmox1)高表達(dá)、催化血紅素heme降解導(dǎo)致游離鐵釋放導(dǎo)致；鐵聚集進(jìn)而激活鐵依賴的組蛋白去甲基化酶Kdm6b，后者促進(jìn)髓系細(xì)胞相關(guān)分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等轉(zhuǎn)錄表達(dá)，募集髓系來源抑制性細(xì)胞MDSC、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM等，促進(jìn)前列腺癌腫瘤免疫抑制。作者明確了Hmox1/iron/Kdm6b信號軸在維持FerroCAF細(xì)胞鐵富集表型、促腫瘤免疫抑制活性方面的關(guān)鍵作用。基于此，作者提出：通過抑制劑干預(yù)Hmox1/iron/Kdm6b信號軸，能有效抑制FerroCAF活性、促進(jìn)Cd8+T細(xì)胞浸潤、激活抗腫瘤免疫活性的治療策略。作者還在其他癌癥類型，例如小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、惡性卵巢癌臨床組織樣本中也證實(shí)了FerroCAF跨癌種存在，也提示阻斷FerroCAF免疫抑制活性，激活以前列腺癌為代表的“冷腫瘤”的抗腫瘤免疫活性，具有廣譜可適性。