動物活體成像技術(shù)主要包括生物發(fā)光與熒光發(fā)光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是利用熒光素酶基因標記DNA，通過基因表達產(chǎn)生的蛋白酶與相應底物發(fā)生化學反應產(chǎn)生光信號（圖1）。熒光發(fā)光采用熒光物質(zhì)或熒光物質(zhì)標記的抗體、納米材料、藥物等導入到活體體內(nèi)，通過外界激發(fā)光源激發(fā)獲取成像。
 

圖1 生物發(fā)光活體成像檢測原理

 

通過活體成像技術(shù)可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達和藥物作用效果等生物學過程。前期小愛介紹了兩種活體發(fā)光成像技術(shù)在科學研究中的應用案例，我們可以根據(jù)自己的實驗需求結(jié)合技術(shù)的優(yōu)缺點（表1）選擇合適的體內(nèi)發(fā)光技術(shù)。

 

表1 生物發(fā)光與熒光發(fā)光成像技術(shù)優(yōu)缺點

成像設備	優(yōu)點	缺點	應用領(lǐng)域
生物發(fā)光成像	實時長期監(jiān)測體內(nèi)的各種生物學過程； 背景噪聲低，靈敏度高； 無放射性，不損傷體內(nèi)正常細胞。	成本較高； 波長短穿透力差； 細胞構(gòu)建耗時費力。	基因表達，細胞、病毒和細菌示蹤等。
熒光成像	簡單、方便、價廉； 標記靶點多樣； 易于被大多數(shù)研究人員接受。	背景噪音強，靈敏度低； 染料可能有毒性。	基因表達，蛋白和小分子、細胞、病毒和細菌示蹤等。

 

本期小愛以生物發(fā)光成像實驗為例帶大家一起學習動物活體成像實驗具體操作流程。

 

一個完整的生物發(fā)光活體成像過程包括構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒、細胞轉(zhuǎn)染和篩選、熒光素酶活性鑒定陽性克隆，再將陽性克隆細胞移植到體內(nèi)建立動物模型，進而通過小動物活體成像系統(tǒng)檢測動物體內(nèi)特定部位發(fā)出的熒光信號。最后取出腫瘤組織，通過染色進行病理形態(tài)學分析。

 

1、構(gòu)建熒光素酶重組質(zhì)粒

含熒光素酶的重組質(zhì)粒根據(jù)實驗需求可以自己實驗室構(gòu)建，也可以來源于其它實驗室惠贈或市售。

 

2、細胞轉(zhuǎn)染和篩選

常用的細胞轉(zhuǎn)染方法是化學轉(zhuǎn)染法，對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞等），可以使用轉(zhuǎn)染增強劑聚凝胺(abs42025397)來提高轉(zhuǎn)染效率。按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟進行轉(zhuǎn)染即可。

 

為篩選穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細胞的抗生素最低濃度，可以通過建立殺滅曲線來實現(xiàn)，我們以G-418(abs44062790)最佳篩選濃度的確定為例。

1）第一天：處于對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染的細胞按照20-25%的細胞密度（對于需要更高密度來檢測活力的細胞，可增加接種量）。鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2培養(yǎng)過夜；

2）根據(jù)細胞類型，設定合適范圍內(nèi)的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL；

3）第二天：去除舊的培養(yǎng)基，換用新鮮配制的含有相應濃度G-418的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔；

4） 接下來每3-4天更換新的含G-418的培養(yǎng)基；

5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數(shù)來確定阻止未轉(zhuǎn)染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(shù)（通常是7-10天）內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細胞的最低濃度為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞篩選用的工作濃度。

 

3、熒光素酶活性鑒定陽性克隆

篩選的單一抗性克隆傳代至第五代時用多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

1）按1×105個/孔接種到24孔板，24h后裂解細胞，12000rpm，4℃離心10min，收集裂解物；
2）取上清10μL加入96孔白板中，向每孔加入50μL熒光素酶底物，反應片刻讀取熒光值，每個克隆設3個復孔；
3）保留熒光值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留熒光值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個克隆即為陽性克隆。

 

需要注意的是，篩選的陽性克隆細胞數(shù)理論上應與發(fā)光強度具有線性相關(guān)性，并且陽性克隆細胞應和未轉(zhuǎn)染的細胞具有相似的生長趨勢。因此，我們在確定陽性克隆細胞系后可以增加這兩個驗證實驗以確保整個實驗的完整性和可靠性。

 

4、動物模型構(gòu)建

篩選陽性克隆細胞株后，通常需要將細胞注射到動物體內(nèi)構(gòu)建模型，通過體內(nèi)成像觀察腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是也需要根據(jù)腫瘤類型和研究目的，選擇最適合的模型。一般腫瘤細胞的注射方式包括以下幾種：

 

表2 常用腫瘤細胞注射方式

注射方式	操作	用途
皮下	注射部位包括側(cè)腹面、背側(cè)面及腋下。	為血液及皮膚腫瘤相關(guān)研究提供便利。
腹腔	腫瘤細胞注射到小鼠腹腔。通常會引起一定程度的腹水及浸潤性轉(zhuǎn)移。	適合某些腫瘤轉(zhuǎn)移過程，如卵巢癌。
尾靜脈	腫瘤細胞經(jīng)尾靜脈注射，通過肺部的毛細血管網(wǎng)進入動脈血液循環(huán)系統(tǒng)，造成全身多發(fā)轉(zhuǎn)移灶。	常見于血液腫瘤的研究中。
原位	將腫瘤細胞直接注射至原器官，所營造的腫瘤微環(huán)境更接近于人體。	適用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如脊索瘤、腦膠質(zhì)瘤等；前列腺癌、卵巢癌等的轉(zhuǎn)移研究。
脾臟	將腫瘤細胞注射在脾臟后通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到肝臟。	可以更好地模擬肝轉(zhuǎn)移瘤形成。
左心室	腫瘤細胞經(jīng)過左心室注射進入小鼠體循環(huán)，經(jīng)過一系列過程，最終造成不同器官的轉(zhuǎn)移。	常用于研究骨、腦及乳腺癌轉(zhuǎn)移。

 

小愛以裸鼠皮下移植瘤模型的建立為例，具體實驗步驟如下：

1）BALB/c nude裸鼠，4周齡，體重（15±2）g，雌雄各3只；
2）取對數(shù)生長期的熒光素酶陽性克隆細胞，用PBS重懸為55×107/mL 懸液，每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100μL，共接種6只；
3）接種后第5天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強度。以后每5天觀察一次，連續(xù)觀察30天；
4）觀察前按150mg/kg體重的量腹腔注射底物D-熒光素(abs42017256)，10分鐘后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液，進行活體成像觀察皮下腫瘤的生長情況，定量分析各時間點的熒光值，繪制腫瘤皮下生長曲線。

 

5、病理形態(tài)學觀察

病理形態(tài)學觀察常見的染色方式有HE、IF、IHC、mIHC等，染色原理及作用如表3，可以根據(jù)實驗需求選擇合適的方法進行染色分析。值得注意的是，隨著科學家對疾病的深入探究，越來越多的科研學者更傾向于mIHC染色技術(shù)，而且發(fā)表的文章影響因子相對較高。

 

動物活體成像觀察結(jié)束后，脫頸處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm，按照試劑盒說明書的操作步驟經(jīng)染色后觀察組織細胞的病理形態(tài)。

 

表3 HE、IF、IHC、mIHC染色方法的區(qū)別

染色方法	染色原理	作用
HE：蘇木精—伊紅染色	蘇木精為堿性染液，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。	可顯示組織正常與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)
IF：免疫熒光	抗原與抗體特異性結(jié)合，將熒光素標記在抗體或抗原上，然后與其對應的抗原或抗體結(jié)合。	檢測組織中蛋白以及特異性細胞的表達分布。
IHC：免疫組化	抗原與抗體特異性結(jié)合，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子和同位素）顯色。	確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及相對定量。
mIHC：多重熒光免疫組化	TSA酪酰胺信號放大技術(shù)&抗原與抗體特異性結(jié)合，可標記多個靶點（4~7種顏色）。	對靶蛋白或核酸進行高密度原位標記，使檢測信號幾何級放大。

 

（注：本文來源于文獻總結(jié)，僅供參考）

 

活體動物光學成像技術(shù)讓研究人員能夠觀察活體動物體內(nèi)的基因表達和細胞活動，是將分子及細胞生物學技術(shù)從體外研究發(fā)展到活體動物體內(nèi)的強有力手段，該技術(shù)推進了人們對各種生命活動、疾病過程的深入認識，正在被越來越廣泛地應用于生物學及醫(yī)學研究領(lǐng)域。