炎癥小體是一種大分子蛋白質(zhì)復(fù)合物，當(dāng)細(xì)胞遇到病原體或無菌損傷時(shí)，它負(fù)責(zé)控制一系列炎癥相關(guān)蛋白的加工。NLRP3炎癥小體廣泛表達(dá)，可被各種刺激激活。NLRP3炎癥小體的激活包括經(jīng)典和非經(jīng)典通路。經(jīng)典通路誘導(dǎo)caspase-1激活，促使IL-1β/IL-18活化。

小鼠caspase-11或人類對(duì)應(yīng)的caspase-4則啟動(dòng)了非經(jīng)典的炎癥小體信號(hào)通路。它們可以識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的脂多糖（LPS），引起gasdermin D（GSDMD）活化，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡，同時(shí)激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)IL-1β釋放。這種免疫反應(yīng)是宿主應(yīng)對(duì)病原體感染時(shí)的重要一環(huán)。不過，caspase-11具體是通過何種機(jī)制引起NLRP3的活化，目前還有待查明。

北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院夏朋延研究團(tuán)隊(duì)與中科院微生物所王碩研究團(tuán)隊(duì)近日對(duì)非經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活通路進(jìn)行了深入研究。他們發(fā)現(xiàn)孤兒受體Nur77與胞內(nèi)LPS結(jié)合并激活非經(jīng)典通路。這項(xiàng)成果于2023年3月30日發(fā)表在《Immunity》雜志上。
 

圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.03.003）

研究材料與方法
為了研究非經(jīng)典NLRP3炎癥小體激活通路，研究人員使用了多種基因敲除小鼠，包括Nr4a1^–/–、Nlrp3^–/–、Casp4^–/–、Gsdmd^–/–、Aim2^–/–和Tlr4^–/–（均由賽業(yè)生物提供）。研究人員從這些小鼠中獲取BMDM細(xì)胞，或直接開展研究。他們采用pull-down實(shí)驗(yàn)來分析多個(gè)組分的相互作用，并采用酵母雙雜交和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)來分析Nur77與NLRP3的結(jié)合。

技術(shù)路線
01 質(zhì)譜分析篩選出Nur77是LPS的胞內(nèi)結(jié)合蛋白
02 一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)Nur77能夠與NLRP3結(jié)合，但需要LPS和dsDNA同時(shí)存在
03 dsDNA的來源是線粒體，需要GSDMD在線粒體上打孔
04 Nur77加劇了宿主對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)

研究結(jié)果
1.Nur77是LPS的胞內(nèi)受體
為了識(shí)別LPS的胞內(nèi)結(jié)合蛋白，研究人員對(duì)骨髓來源的巨噬細(xì)胞（iBMDM）進(jìn)行質(zhì)譜分析。除了caspase-11，還有9種蛋白也是推定的LPS結(jié)合對(duì)象。之后他們利用CRISPR-Cas9技術(shù)生成了缺失這些蛋白的iBMDM細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有缺失Casp11（編碼caspase-1）和Nr4a1（編碼核受體Nur77）的細(xì)胞在LPS刺激下無法分泌IL-1β，這表明Nur77可能在非經(jīng)典炎癥小體信號(hào)通路中起作用。

他們從Nr4a1^-/-小鼠（賽業(yè)生物提供）中生成了原代BMDM細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染LPS后，Nr4a1^-/- BMDM細(xì)胞的caspase-1沒有活化，而caspase-11或GSDMD活化不受影響。同時(shí)，Nr4a1^-/-細(xì)胞的IL-1β分泌減少，但細(xì)胞焦亡不受影響。這些結(jié)果表明，Nur77對(duì)非經(jīng)典NLRP3炎癥小體的激活至關(guān)重要。

研究人員懷疑，Nur77是胞內(nèi)LPS的真正傳感器。非變性凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，與LPS孵育的Nur77遷移得比單獨(dú)的Nur77慢，表明這兩個(gè)分子之間存在直接結(jié)合。生物素標(biāo)記的LPS可在pull-down分析中沉淀重組Nur77，進(jìn)一步表明Nur77是LPS的胞內(nèi)受體。此外，他們還確定了Nur77的C端結(jié)構(gòu)域參與了與LPS的結(jié)合，缺乏第524-547位氨基酸的Nur77無法與LPS結(jié)合。

2.Nur77在LPS和dsDNA的幫助下激活NLRP3炎癥小體
基于這些結(jié)果，研究人員假設(shè)Nur77在caspase-11和GSDMD下游的NLRP3炎癥小體激活中發(fā)揮了作用。為了研究具體的分子機(jī)制，他們開展了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，證實(shí)Nur771-287與NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域存在相互作用。在HEK293T細(xì)胞中，他們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察到Nur771-357與全長NLRP3結(jié)合，但沒有觀察到全長Nur77與全長NLRP3的結(jié)合。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)只有在LPS和包含NBRE的dsDNA存在時(shí)，Nur77才能與NLRP3結(jié)合（圖1）。在受到LPS刺激的BMDM細(xì)胞中，他們通過免疫熒光染色觀察到Nur77和NLRP3是共定位的。
 

Nur77在LPS和dsDNA存在時(shí)與NLRP3結(jié)合^[1]

那么，這個(gè)dsDNA的來源是不是線粒體？為了確定GSDMD是否能夠?qū)е戮奘杉?xì)胞中線粒體DNA的釋放，研究人員將LPS轉(zhuǎn)染到BMDM細(xì)胞中，并對(duì)各個(gè)細(xì)胞組分進(jìn)行分離。結(jié)果表明，裂解的GSDMD存在于線粒體部分，且釋放到胞質(zhì)中的線粒體dsDNA增加。同時(shí)，線粒體DNA的耗盡會(huì)導(dǎo)致BMDM細(xì)胞在LPS刺激后的NLRP3炎癥小體激活減少。在Nr4a1^-/- BMDM細(xì)胞中，若釋放線粒體DNA的通道被抑制，則非經(jīng)典NLRP3炎癥小體的激活受到影響。這些結(jié)果表明，GSDMD在線粒體上打孔，將線粒體DNA釋放到胞漿中，這對(duì)于Nur77的活化至關(guān)重要。

考慮到GSDMD在非經(jīng)典NLRP3炎癥小體的激活中起著關(guān)鍵作用，他們利用Gsdmd^-/- BMDM細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)，以確定Nur77與NLRP3之間的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)，Gsdmd^-/-細(xì)胞在受到LPS刺激后，Nur77不再與NLRP3結(jié)合，也未觀察到Nur77與線粒體DNA的結(jié)合。同樣地，在Casp11^-/- BMDM細(xì)胞中，Nur77與NLRP3之間的結(jié)合也受到影響（圖2）。因此，Nur77需要caspase-11來加工GSDMD以激活非經(jīng)典的NLRP3炎癥小體。缺乏DNA結(jié)合域或LPS結(jié)合位點(diǎn)的Nur77不能促進(jìn)NLRP3的激活。
 

Nur77對(duì)NLRP3的激活依賴caspase-11和GSDMD^[1]

3.Nur77缺乏減輕宿主對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)
最后，研究人員分析了Nur77在膿毒癥中的作用。他們用poly（I：C）對(duì)野生型、Nr4a1-/-、Nlrp3-/-和Casp11-/-小鼠（賽業(yè)生物提供）進(jìn)行預(yù)處理后注射LPS，發(fā)現(xiàn)Nr4a1^-/-小鼠血清中的IL-1β水平降低，與Nlrp3^-/-小鼠相似。分離小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Nr4a1缺失不影響細(xì)胞焦亡。在注射致死劑量的LPS后，Nr4a1^-/-小鼠存活時(shí)間更長。這些結(jié)果表明，Nur77會(huì)加劇宿主對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)。

研究結(jié)論

Nur77與LPS結(jié)合激活非經(jīng)典NLRP3炎癥小體的示意圖^[1]

總的來說，這項(xiàng)研究表明Nur77作為細(xì)胞內(nèi)的LPS傳感器，與線粒體DNA和LPS結(jié)合，激活非經(jīng)典NLRP3炎癥小體通路（圖3）。作者認(rèn)為，Nur77為caspase-11的激活和下游NLRP3炎癥小體的形成搭建了橋梁，有望為炎癥性疾病和膿毒癥的治療提供靶點(diǎn)。

原文檢索：

[1]Zhu F, Ma J, Li W et al., The orphan receptor Nur77 binds cytoplasmic LPS to activate the non-canonical NLRP3 inflammasome. Immunity (2023), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.03.003