4 PCR反應特點

4.1特異性強   
PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10^-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10^-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
4.3簡便、快速
PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，經過變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標本的純度要求低
不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

5 PCR常見問題

5.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有：
（1）模板核酸的制備
①模板中含有雜蛋白質；
②模板中含有Taq酶抑制劑；
③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚；
⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本
的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，
其程序亦應固定不宜隨意更改。
（2）引物的質量與特異性
引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條
帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一
條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有
引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物
無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度
高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物
變質降解失效。
④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
（3）酶的質量
             酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
（4）Mg²⁺濃度
Mg²⁺離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異
性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
（5）反應體積的改變
通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul或100ul，應用多大體積
進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，
再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
（6）物理原因
變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)
假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高
影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢
測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
（7）靶序列變異
如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺
失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
5.2 假陽性
　　    出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
　　   （1）引物設計不合適
選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，
擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假
陽性。需重新設計引物。
　　   （2）靶序列或擴增產物的交叉污染
這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍
內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消
毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管
和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這
些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇樱�與引物互補后，可擴
增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
5.3 出現(xiàn)非特異性擴增帶
　　       非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg²⁺離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。對策有：
①必要時重新設計引物；
②減低酶量或調換另一來源的酶；
③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；
④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
　　       PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg²⁺濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。對策為：
①減少酶量，或調換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。適當降低Mg²⁺濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。