各個環(huán)節(jié)高效提高NK細胞純度的方法介紹
NK細胞無需抗原預先致敏，即可快速反應并同時激活免疫系統(tǒng)來協(xié)同發(fā)揮殺傷作用，堪稱免疫細胞里的航空母艦�？茖W家對NK細胞療法也寄予厚望，全球的NK細胞相關療法也在如火如荼的進行著。如何高效利用NK細胞幫助我們戰(zhàn)勝疾病，科學家們?yōu)榇艘恢痹谂χ�，今天我們就來系統(tǒng)的了解一下如何在各個環(huán)節(jié)提高NK細胞的純度，以達到最好的治療效果。
Fig1：NK 細胞的來源
首先我們需要了解NK細胞是一種自然免疫細胞，廣泛存在于人體的外周血、骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中。在細胞來源方面，外周血中的NK細胞含量較高，是常用的來源之一【1】，另外臍帶血產(chǎn)業(yè)在近幾年迅速發(fā)展，也成為NK細胞主要來源之一。除此之外，也可以從人體骨髓、脾、淋巴結(jié)等組織中獲得NK細胞，但這些來源的細胞數(shù)較少，需要經(jīng)過特殊處理才能得到足夠的細胞量。
01 血樣采集和處理
首先，需要從健康人體中采集血樣進行實驗。為了避免血液的凝固和失活，建議在血樣采集后盡快進行處理。外周血采集建議首選肝素鈉采血管，最好在采血后4小時內(nèi)安排分離實驗。而采集臍血無法選用采血管，必須用采血袋，建議使用抗凝劑較少的采血袋（比如100ml的袋子內(nèi)含14ml抗凝保存液），以更大程度防止血鈣流失。血液處理可以使用Ficoll梯度離心分離法（以外周血為例），具體方法如下：
Fig2：梯度離心分離法
1、將采集的外周血室溫下進行離心處理（操作前請進行檢菌），離心15分鐘，離心速度設置為750g左右。此時，血液將被分為兩個層次：上層為血漿，下層為白細胞、紅細胞和粘稠物。
2、自體血漿分離
2.1 操作1離心結(jié)束后用移液管將上層血漿轉(zhuǎn)入離心管進行密封滅活（血漿放入水浴鍋56℃滅活半小時），滅活后的血漿置于4℃冰箱半小時，防止補體、血小板等對細胞活化產(chǎn)生影響；
2.2 取出冰箱血漿進行再次離心，離心10分鐘，離心速度1000g左右，取上清作為自體血漿置于4℃冰箱備實驗需用。
3、單個核細胞PBMC分離
3.1 操作1離心結(jié)束后獲得的血細胞沉淀用等體積生理鹽水重懸混勻，然后將混勻的血細胞緩慢加入到離心管中Ficoll層上（確保分層清晰）；
3.2 將離心管放入離心機進行離心處理，離心25分鐘，離心速度930g左右，離心結(jié)束后棄去上清并吸取白膜層細胞（盡量吸盡液面交界處的細胞層）
3.3 吸取到的白膜層細胞放入新的離心管，用生理鹽水重懸混勻定容至100mL并進行離心處理，離心8分鐘，離心速度750g；
3.4 可再次洗滌細胞。棄上清，重懸細胞，吸取少量細胞計數(shù)。調(diào)整細胞密度后種瓶。
02 刺激激活
為了提高NK細胞的殺傷活性，需要在細胞培養(yǎng)基中添加一些刺激劑，如IL-2、IL-15等。IL-2和IL-15的加入可以促進NK細胞的增殖和分化，同時提高細胞的殺傷活性。在激活NK細胞時，我們將其培養(yǎng)在含有IL-2和IL-15的培養(yǎng)基中，以促進細胞的增殖和活化。不過值得注意的是，從PBMCs誘導培養(yǎng)也會刺激CD3+ T和NKT（CD3+CD56+）細胞的擴增。因此，基于異體移植可能引起的T細胞介導的同種異體反應性，可以考慮提前通過磁分選消除其他免疫細胞，以便培養(yǎng)可以獲得高純度的NK細胞，這也是CAR-NK細胞制備獲得高純度細胞的關鍵。
實驗內(nèi)容如下：
1、完全培養(yǎng)基配置：1L培養(yǎng)基加入IL-2，終濃度為 1000IU/mL。
2、細胞計數(shù)：用少量完全培養(yǎng)基重懸細胞（PBMCs），吸取少量細胞計數(shù)。調(diào)整細胞密度1.5-2×106 個/mL。
3、種瓶：將細胞懸液中加入激活因子和滅活血漿，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)終體積約 25mL(為了更有效刺激NK細胞激活，可提前采用包被液包被培養(yǎng)瓶)。
4、將培養(yǎng)瓶放入37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間每隔一天補充一次培養(yǎng)基。
5、培養(yǎng)7天后，我們將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋繼續(xù)培養(yǎng)。
當NK細胞被激活時，檢測的維度是多樣的，可以檢測活性、殺傷毒性等等，常見的方法有以下三種：
1.流式細胞術（Flow cytometry）：流式細胞術是一種常用的檢測方法，可以通過檢測表面標記物和內(nèi)部蛋白來確定細胞類型和功能。通過使用特定的抗體，可以檢測到激活的NK細胞表面上的活化標記物，如CD16、CD56、和CD137等。
2.細胞活性測定（Cellular cytotoxicity assay）：細胞活性測定可以評估NK細胞的殺傷能力。在這種測試中，將被測細胞與腫瘤細胞共同培養(yǎng)，然后測量腫瘤細胞的死亡率。如果激活的NK細胞對腫瘤細胞有殺傷作用，那么腫瘤細胞死亡率將會升高【2】。
3．酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）：ELISA可以檢測細胞因子和其他蛋白質(zhì)的表達水平。在NK細胞激活的情況下，細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）等會被分泌出來。通過檢測這些分泌的細胞因子水平，可以評估NK細胞的激活狀態(tài)。
Fig3：NK細胞毒性測定
03 擴增階段
在完成刺激激活之后，NK細胞需要進行擴增培養(yǎng)，以增加其數(shù)量和活性，以便進行后續(xù)的實驗和應用。在培養(yǎng)NK細胞時，我們需要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以促進細胞的生長和分化。最常用的培養(yǎng)基是無血清免疫細胞培養(yǎng)基，其中包含必需氨基酸、維生素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)。此外，還可以添加一些生長因子，如白細胞介素-2（IL-2），以促進NK細胞的生長和擴增。在一些研究中，還會添加一些其他的細胞因子，如白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-15（IL-15）、白細胞介素-18（IL-18）、白細胞介素-21（IL-21）等，以提高NK細胞的細胞毒性和殺傷作用。
其中IL-2在短時間內(nèi)可促進NK細胞的存活、并激活提高細胞毒性。主要由于IL-2刺激PBMCs可導致淋巴因子激活的殺傷細胞LAK數(shù)量增加（LAK前體細胞是由NK細胞和T細胞組成），因此對自體腫瘤細胞具有較高的殺傷能力；其次IL-2和IL-15聯(lián)合應用可促進NK細胞的增殖和活性，更有利于NK細胞的激活，特別的是IL-2和IL-15聯(lián)用可誘導NK細胞活化受體NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表達，提高其對腫瘤細胞株的細胞毒性；研究表明IL-12也可用于體外NK細胞培養(yǎng)，刺激NK細胞產(chǎn)生IFN-γ；另外IL-12、IL-15和IL-18聯(lián)合可以誘導細胞因子誘導的記憶樣NK細胞（CIML），CIML是一種壽命長、細胞毒性高、分泌IFN-γ的細胞。CIML-NK細胞已在小鼠腫瘤模型中進行過繼免疫治療，并顯示出抗黑色素瘤和淋巴瘤的良好效果；白細胞介素-21是一種四螺旋束的細胞因子，對淋巴細胞和骨髓細胞具有多種生物學效應，能誘導NK細胞的成熟，并增強其細胞毒性，并且IL-21與IL-2或IL-15組合能誘導NK細胞的增殖，對NK 細胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
在擴增培養(yǎng)過程中，我們還需要注意一些關鍵的指標，如細胞密度、細胞存活率和細胞表面標志物的表達情況等。通常，NK細胞的最佳擴增密度為1-2×106/mL。為了保證細胞的生長和分化，我們需要每2-3天補充新的培養(yǎng)基，并添加適量的生長因子和自體血漿。除了培養(yǎng)基、生長因子和自體血漿之外，還需要注意細胞培養(yǎng)的溫度、濕度和二氧化碳濃度等條件。NK細胞的最佳培養(yǎng)條件為37℃、5% 二氧化碳。在擴增培養(yǎng)過程中，我們還需要檢測細胞的活性和表面標志物的表達情況，以確保細胞的質(zhì)量和適用性。最常用的檢測方法是流式細胞術，通過特定的熒光標記物和抗體，可以對細胞表面標志物的表達情況進行檢測和分析。
結(jié)語：科學家們?yōu)榱嗽隰~龍混雜的體系之中提純出NK細胞進行了數(shù)十年的研究，我們從上文的方法可以看出各種方法都存在自己的優(yōu)越性以及局限性，這就需要我們學會理性分析自己的需求特點，選擇合適的提純方案，并在實踐中不斷優(yōu)化和改進技術。我國的NK細胞療法起步雖然略慢，但是我們充分利用了產(chǎn)業(yè)模式以及廣納最新的科學技術，發(fā)展出許多NK細胞提純的平臺，為我國NK細胞相關研究和應用保駕護航。在疫情陰霾完全散去的今天，我國的免疫治療領域正如NK細胞本身一樣，在監(jiān)管反應和協(xié)同方面同時發(fā)力，為戰(zhàn)勝疾病貢獻自己的力量。
參考文獻：
【1】Rossi F, Fredericks N, Snowden A, Allegrezza MJ, Moreno-Nieves UY. Next Generation Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Front Immunol. 2022 Jun 2;13:886429.
【2】 Kim J, Phan MT, Kweon S, Yu H, Park J, Kim KH, Hwang I, Han S, Kwon MJ, Cho D. A Flow Cytometry-Based Whole Blood Natural Killer Cell Cytotoxicity Assay Using Overnight Cytokine Activation. Front Immunol. 2020 Aug 14;11:1851.
【3】 Kim TJ, Kim M, Kim HM, Lim SA, Kim EO, Kim K, Song KH, Kim J, Kumar V, Yee C, Doh J, Lee KM. Homotypic NK cell-to-cell communication controls cytokine responsiveness of innate immune NK cells. Sci Rep. 2014 Dec 5;4:7157.
