茶葉中草甘膦和氨甲基膦酸殘留量的測(cè)定
草甘膦（GLY）是一種高效、低毒、廉價(jià)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑，被廣泛施用于茶園等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。隨著草甘膦的廣泛使用，其在茶葉、水果等植物源食品中殘留量的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注。草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸具有極性強(qiáng)、易溶于、難溶于各種有溶劑，這給常規(guī)檢測(cè)帶來(lái)了極大的困難和挑戰(zhàn)。
逗點(diǎn)生物在2021年推出過(guò)檢測(cè)茶葉中Copure®草甘膦的專用柱（貨號(hào)：COGLY3000）及其應(yīng)用方案。
然而，客戶在方法開發(fā)時(shí)依然遇到了很多問(wèn)題，如方法很難重現(xiàn)、峰形不好、質(zhì)譜找不到母離子等，鑒于此我司對(duì)該法進(jìn)行了完善，詳細(xì)考察了其前處理?xiàng)l件，并用優(yōu)化后的方法對(duì)紅茶、綠茶、青茶進(jìn)行了樣品處理，都能夠獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本文把完善后的方案及優(yōu)化過(guò)程一并呈現(xiàn)給大家，供參考。
一、樣品提取
準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎的茶葉1.0 g于50 mL離心管中，加入濃度為 10 μg/mL草甘膦內(nèi)標(biāo)100 μL，再加入10 mL 水，渦旋混勻15 min，超聲提取15 min，以10000 r/min離心5 min，待凈化。
二、樣品凈化
移取5 mL上清液至50 mL 離心管中，加入5 mL二氯甲烷，渦旋混勻5 min，以10000 r/min離心5 min，取2.5 mL上清液過(guò)固相萃取柱（使用前用3 mL甲醇和3 mL水活化），棄掉前端幾滴液體，再收集后續(xù)流出液，待衍生。
▲Copure®草甘膦專用柱▲
三、衍生
取1.0 mL 上述的凈化液，加入0.2 mL 50 g/L 硼酸鈉緩沖溶液，渦旋混勻，再加入0.2 mL 10 g/L FMOC-Cl 丙酮衍生液，渦旋混勻后置于45 ℃下衍生2 h，以10000 r/min離心5 min，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)試。
四、標(biāo)曲配制
吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用水稀釋定容至1.0 mL，使每毫升混合標(biāo)準(zhǔn)工作液含有同位素內(nèi)標(biāo)100 ng/mL。加入 50 g/L 硼酸鈉緩沖溶液0.2 mL，混勻，再加入10 g/L FMOC-Cl溶液0.2 mL，渦旋混勻后同樣品置于45 ℃下衍生2 h，配制成上機(jī)濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL。
五、儀器條件
【液相部分】
色譜柱：Commail® BEH T-C18
(2.1 mm×100 mm,3 μm)
流動(dòng)相：A：5 mmol/L乙酸銨溶液 B：乙腈
流速：0.4 mL/min
柱溫：30℃
進(jìn)樣量：5 μL
洗脫程序：梯度洗脫表1
表1 梯度洗脫程序
【質(zhì)譜條件】
離子源：HESI
電噴霧電壓：3500 V
鞘氣壓力：40 arb
輔氣壓力：10 arb
離子傳輸管：260 ℃
輔氣溫度：350 ℃
表2 組分名稱、保留時(shí)間
及特征離子一覽表（*為定量離子）
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
【測(cè)試數(shù)據(jù)】
表3 加標(biāo)回收率結(jié)果
【測(cè)試色譜圖】
圖1 添加水平為0.50 mg/kg的鐵觀音總離子流圖
七、實(shí)驗(yàn)過(guò)程分析
【衍生劑濃度】
如圖2所示，考察衍生劑濃度分別為1g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L和20g/L，添加量為0.2 mL時(shí)標(biāo)液中目標(biāo)物的峰面積變化，從圖中可以看出衍生劑加入量≥6g/L時(shí)，目標(biāo)物峰面積無(wú)明顯變化�？紤]到樣本中的基質(zhì)會(huì)消耗一定量的衍生劑，建議適當(dāng)增大衍生劑的濃度，方案中衍生劑的濃度為10 g/L。
圖2衍生劑濃度對(duì)目標(biāo)物的影響
【衍生時(shí)間】
考察不同衍生時(shí)間，0.5~4小時(shí)（衍生溫度40℃）及12小時(shí)（室溫過(guò)夜20 ℃）。結(jié)果如圖3所示，草甘膦和氨甲基磷酸在衍生時(shí)間≥2小時(shí)，目標(biāo)物峰面積無(wú)明顯變化，室溫過(guò)夜有利于衍生完成。綜合考慮時(shí)效性，方案中衍生時(shí)長(zhǎng)為2小時(shí)。
圖3 衍生時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的影響
【衍生溫度】
考察不同溫度對(duì)衍生的影響，衍生溫度大于35 ℃時(shí)，草甘膦和氨甲基膦酸以及內(nèi)標(biāo)的峰面積無(wú)太大差異，方案中選擇45℃為衍生溫度。
【硼酸鈉濃度】
如圖5，不同濃度硼酸鈉緩沖溶液對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸以及內(nèi)標(biāo)的衍生影響較小，50g/L硼酸鈉緩沖溶液已經(jīng)能獲得較為理想的衍生效果，而濃度高的硼酸鈉溶液會(huì)污染質(zhì)譜，方案采用50g/L的硼酸鈉。
圖5 硼酸鈉濃度對(duì)目標(biāo)物的影響
【衍生劑存儲(chǔ)時(shí)間】
考察不同存儲(chǔ)時(shí)間的FMOC-Cl對(duì)目標(biāo)物的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。FMOC-Cl存儲(chǔ)時(shí)間對(duì)于草甘膦及其內(nèi)標(biāo)影響較小，但對(duì)氨甲基膦酸有顯著影響，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)峰面積越小。
圖6 衍生劑存儲(chǔ)時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的影響
說(shuō) 明
1）不同類型的茶葉所含干擾基質(zhì)不一樣，實(shí)際處理時(shí)可對(duì)方法進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，如對(duì)顏色深的提取液可多次加入二氯甲烷凈化，且在衍生時(shí)提高衍生劑的濃度。
2）前處理中可加入微量飽和醋酸鉛溶液（如20 μL）,用于沉淀酚類干擾物，此時(shí)可獲得較為澄清的上機(jī)溶液。值得注意的是，醋酸鉛的加入會(huì)導(dǎo)致氨甲基磷酸響應(yīng)變低，但不會(huì)影響草甘膦的響應(yīng)，可綜合考慮選擇性使用。
3）儀器條件優(yōu)化，草甘膦和氨甲基磷酸受基質(zhì)抑制影響嚴(yán)重，靈敏度低的儀器在優(yōu)化時(shí)很難找到相應(yīng)的母離子，此時(shí)，可直接參考文獻(xiàn)或者標(biāo)準(zhǔn)輸入同類型儀器的參數(shù)。
八、訂購(gòu)信息
