做成像的小伙伴大抵都了解，在單分子成像中，信號(hào)往往是極弱的，如何從背景噪聲中pick出有效信號(hào)，是關(guān)鍵所在。為減小背景熒光（來自細(xì)胞的自發(fā)熒光等等）的影響，一般會(huì)采用“TIRF技術(shù)+科研級(jí)相機(jī)”進(jìn)行成像。并較一般的成像應(yīng)用，在靈敏度方面，單分子成像對(duì)相機(jī)的性能要求更為苛刻。

 

EMCCD相機(jī)在很長段時(shí)間里，都是單分子成像的心頭好。一騎絕塵的量子效率（QE）外加電子倍增技能BUFF，妥妥站穩(wěn)C位。除了貴，別的沒什么毛病。

 

不過，隨著sCMOS技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，sCMOS相機(jī)穩(wěn)步地立起了自己的山頭。除擁有了更高的幀速、更多的像素?cái)?shù)目、更高的分辨率，靈敏度/信噪比也得到了明顯的提升。

 

濱松sCMOS相機(jī)（ORCA-Flash 4.0等第二代系列產(chǎn)品）從2015年左右開始，就逐漸被用于了STORM等基于單分子成像的超分辨技術(shù)應(yīng)用中，以獲得更高的幀速、分辨率。

 

濱松兩款高端sCMOS相機(jī)與CCD相機(jī)的性能比較

 

而背照式sCMOS技術(shù)的出現(xiàn)，讓sCMOS相機(jī)陣營又得到了一次飛躍。除了QE已達(dá)到與EMCCD相當(dāng)?shù)乃�平，受益于越來越低的噪聲，信噪比也獲得了進(jìn)一步的提升。進(jìn)而，對(duì)于單分子成像中信號(hào)較弱的場(chǎng)景，有了足夠的靈敏度。一方面，成像質(zhì)量幾乎達(dá)到了媲美EMCCD的程度；一方面，價(jià)格較其還肉眼可見的成倍降低。

 

這性價(jià)比，就說，香不香吧！

 

圖源：bilibili.com

 

拿濱松2020年發(fā)布的首款背照式sCMOS相機(jī)ORCA-FusionBT來看。530萬像素（2304x2304），配合6.5μm的像素尺寸，提供了出色分辨率；信噪比（SNR）方面，兩個(gè)關(guān)鍵影響因素也做到了十分優(yōu)秀的水平：QE高達(dá)95%，讀出噪聲低至0.7erms。

 

 

下面兩個(gè)案例，可以看到這臺(tái)背照式sCMOS在單分子成像中的優(yōu)秀表現(xiàn)，特別是與EMCCD的成像對(duì)比：

 

案例 1

YFP標(biāo)記的膜蛋白單分子TIRF成像

可見濱松ORCA-FusionBT sCMOS相機(jī)與EMCCD相機(jī)的成像效果對(duì)比。（受視頻網(wǎng)站上傳限制影響，圖像質(zhì)量有部分折損，如需觀看原視頻，請(qǐng)?jiān)诹粞詤^(qū)留言。）

案例 2

ORCA-FusionBT sCMOS相機(jī)的單分子成像案例

熒光探針為TagRFP，此案例采用了雙色成像。

 

看到上面的成像效果，大家也就能體會(huì)到，單分子成像在相機(jī)選擇上的“移情別戀”，也是必然的了。

 

而在第二個(gè)案例中，我們看到，該實(shí)驗(yàn)采用了雙色成像。單分子成像經(jīng)常與FRET技術(shù)聯(lián)用，用于在單分子層面研究分子的構(gòu)造變化（如蛋白質(zhì)分子domain之間的距離變化等等）。

 

由于FRET技術(shù)需要對(duì)兩個(gè)波長同時(shí)監(jiān)測(cè)采像，所以一般會(huì)在相機(jī)和顯微鏡之間加裝雙色分光器，通過二向色鏡/濾光片按照波長將信號(hào)分開，并分別成像。

 

針對(duì)這樣的需求，濱松還可供“相機(jī)+雙色分光附件”的雙色同步成像方案。方案可分為單相機(jī)方案與雙相機(jī)方案兩種，前者成本較低，后者則有更大的視野范圍以及更多擴(kuò)展功能（如物鏡后焦面成像、PSF修飾等）。

 

濱松雙色分光附件W-View GEMINI系列

 

使用這套的雙色成像方案的單分子FRET成像案例，可以參閱The bright future of single-molecule fluorescence imaging, Curr Opin Chem Biol. (2014) 20:103-111這篇文獻(xiàn)。其中，作者采用濱松sCMOS相機(jī)與W-View GEMINI雙色分光器配合，得到了最高2ms時(shí)間分辨率的單分子FRET成像，分析了核糖體pre-translation complex的動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)變化。

 

Ok~單分子成像此次就聊到這里。而關(guān)于剛剛提到的單相機(jī)雙色同步成像、雙相機(jī)雙色同步成像這兩套方案，咱們就在下一期推文中，再為大家做詳細(xì)介紹啦~歡迎關(guān)注~