1. 正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1） 固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

（3） 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

（4） 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

3. 標本收集：標本收集及保存的好壞，直接決定了實驗?zāi)芊癯晒ΑＴ谑占瘶吮局�前必須考慮到實驗對標本收集及保存的要求，這些要求對標本中待測物質(zhì)穩(wěn)定性影響很大。以ELISA為例。ELISA檢測的一般是液態(tài)標本，應(yīng)在收集到新鮮標本后立即離心留取上清液1ml左右移入高溫滅菌過的1.5ml EP管中。這種標本在4度保存48小時，-20度保存1個月，-80度保存6個月對檢測影響不大。樣本一般都是怕反復凍融的，這樣會使蛋白降解，如需做預實驗或需反復取用標本時，應(yīng)在收集時即分裝幾個EP管（管外注意用標號筆標記好）。

4. 實驗前的準備工作：100μl加樣槍及槍頭，1000μl加樣槍及槍頭，100ml量筒（洗凈并雙蒸水沖洗），500ml量杯（洗凈并雙蒸水沖洗，實驗室沒有更小的了），雙蒸水100ml（稀釋洗滌液用），吹氣球，吸水紙（定性濾紙），試管架，避光濕盒，酶標板框，定時器，膠帶，剪刀，棄物盒及廢液缸；100μl中槍頭、1000μl大槍頭、1.5ml EP管需事先滅菌好；多次使用的酶標板框應(yīng)洗凈烘干。

5. 準備實驗時，預先讓37度恒溫箱升溫至37度；樣品和試劑盒在室溫下平衡30分鐘以上。

6. ELISA試劑盒固化的抗體在底部，加樣時槍頭千萬不要碰到底部；用不完整個試劑盒可以分開用，但分時一定不要摸底部，原因同前。 

7. 每次孵育時用膠帶封住酶標板口，防止水份蒸發(fā)。

8. 微孔板一般是一排8個，在其一端排頭的邊緣用記號筆標記下順序（如1，2，3...），以免手工洗板過程中板朝下拍時不慎致微孔板掉出酶標板框而無法確認順序。

9. 加標準品和樣品時每次都要更換一個槍頭，避免重復使用槍頭而交叉污染。

10. 37度溫育后千萬不要忘記倒掉微孔板中的液體（包含未結(jié)合上的酶聯(lián)親和物，其殘留必然造成假陽性），并且反復用稀釋好的洗滌劑洗板。 

11. 應(yīng)做預實驗和標準曲線，如果多數(shù)樣本測值在最高OD值處波動，要稀釋后再重做，然后按稀釋倍數(shù)算出來最終結(jié)果，因為試劑盒是有測試范圍的。

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