當人體暴露于有害刺激時，外周感覺神經會檢測到這些刺激，并與免疫細胞積極合作，協(xié)同調節(jié)宿主防御。脾臟是最大的次級淋巴器官，也是體液免疫反應的主要樞紐。然而，脾臟內感覺神經纖維的分布和功能仍不是太清楚。

傷害性感受器（nociceptor）是感覺神經元中的一個主要亞群，特點是表達離子通道，通過感知各種有害刺激來保護生物體。值得注意的是，傷害性感覺神經元在先天性免疫反應中的免疫調節(jié)功能日益受到重視。這些神經纖維會在局部釋放神經肽，包括降鈣素基因相關肽（CGRP），通過向免疫細胞或血管細胞傳遞信號來調節(jié)炎癥反應。不過，傷害性感覺神經元在B細胞反應和體液免疫中的潛在作用仍是個謎。

近日，軍事科學院軍事醫(yī)學研究院李慧艷、張宇程和周濤領導的研究團隊發(fā)現(xiàn)，傷害性感覺神經元廣泛支配脾臟，并促進生發(fā)中心（GC）反應和體液免疫。這項研究成果于5月20日發(fā)表在頂級期刊《Cell》上，建立了一條通過背根神經節(jié)-脾臟神經連接調節(jié)體液免疫的途徑，有望通過靶向傷害性感覺神經系統(tǒng)來提高宿主防御能力。
 

圖片來源：《Cell》
（https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.027）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構建了多個小鼠模型來研究傷害性感覺神經在脾臟中的潛在作用。例如，他們將Trpv1-Cre小鼠與Rosa26-LSL-DTR小鼠（賽業(yè)生物提供）交配，在注射白喉毒素后切除小鼠背根神經節(jié)中的傷害性感覺神經。他們還利用itdTomato⁺小鼠（賽業(yè)生物提供）來追蹤神經元的位置。此外，研究人員還使用了Calcrl^fl/fl小鼠和Ramp1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）以研究脾臟生發(fā)中心反應的分子機制。

技術路線
01 對傷害性感覺神經元的標志物CGRP進行染色，觀察這些神經在脾臟中的位置
02 通過神經元示蹤劑追蹤到，傷害性感受器來源于左側T8-T13背根神經節(jié)
03 通過多個小鼠模型探究傷害性感受器促進生發(fā)中心反應的分子機制
04 驗證辣椒素是否可激活傷害性感受器并增強抗病毒免疫力

研究結果
1. 傷害性感覺神經元促進脾臟生發(fā)中心反應
為了確定脾臟是否受到傷害性感覺神經元支配，研究人員采用了一種稱為SHANEL的組織透明化方法。在透明化后，對傷害性感覺神經元的特異性標志物CGRP進行染色，隨后進行3D成像。他們興奮地觀察到，脾臟受CGRP⁺傷害性感覺神經支配，這些神經在脾臟內形成復雜而廣泛的網絡。在進一步分析后，他們發(fā)現(xiàn)傷害性感覺神經深入脾臟實質，并沿著血管到達B細胞區(qū)。

研究人員將Trpv1-Cre小鼠與Rosa26-LSL-DTR小鼠（iDTR，由賽業(yè)生物提供）交配產生了Trpv1-Cre⁺iDTR⁺小鼠，以便探究傷害性感覺神經元在脾臟中的潛在作用。在注射白喉毒素（DT）后，小鼠背根神經節(jié)和結狀神經節(jié)中的TRPV1⁺傷害性感覺神經元被有效切除。之后利用經典的NP-KLH抗原對小鼠進行免疫，以引發(fā)體液免疫反應。他們發(fā)現(xiàn)，傷害性感受器缺失會導致小鼠生發(fā)中心B細胞、脾臟漿細胞以及NP特異性IgG抗體滴度顯著下降，表明傷害性感覺神經元對脾臟生發(fā)中心反應和體液免疫至關重要。

2. 支配脾臟的傷害性感受器來源于左側T8-T13背根神經節(jié)
為了追蹤脾臟傷害性感覺神經纖維的起源，研究人員在小鼠脾內注射逆行神經元示蹤劑——偽狂犬病毒（PRV）。他們發(fā)現(xiàn)，支配脾臟的傷害性感覺神經元主要分布在背根神經節(jié)內，而不是雙側結狀神經節(jié)（圖1）。值得注意的是，這些細胞體主要位于脾臟同側的左側T8-T13背根神經節(jié)。將順行示蹤劑AAV9-Trpv1-Cre病毒注射到itdTomato⁺小鼠（由賽業(yè)生物提供）左側T8-T13背根神經節(jié)后，他們觀察到TRPV1-tdTomato⁺ CGRP⁺傷害性感覺神經纖維支配脾臟（圖1）。這些數據表明，支配脾臟的傷害性感受器主要來源于左側T8-T13背根神經節(jié)。
 

圖1 支配脾臟的傷害性感受器主要來源于左側T8-T13背根神經節(jié)^[1]

那么，背根神經節(jié)與脾臟的神經連接是否會對脾臟生發(fā)中心反應產生影響？研究人員發(fā)現(xiàn)，在切除小鼠左側T8-T13背根神經節(jié)中的TRPV1⁺神經元后，NP-KLH抗原誘導的生發(fā)中心B細胞、脾臟漿細胞以及NP特異性抗體顯著減少；但切除右側的對應神經元不會產生此類影響。此外，激活左側T8-T13背根神經節(jié)中的傷害性感受器顯著增強了脾臟生發(fā)中心反應。這些結果證實，來源于左側T8-T13背根神經節(jié)的傷害性感覺神經元在脾臟生發(fā)中心反應和體液免疫中發(fā)揮關鍵作用。

3. CGRP受體CALCRL-RAMP1通過cAMP信號通路促進生發(fā)中心反應
支配內臟器官的傷害性感受器可被駐留的微生物病原體及其產物直接激活。激活后，傷害性感受器的神經末梢在局部釋放神經肽（比如CGRP），然后直接作用于目標細胞并調節(jié)下游生理功能。研究人員發(fā)現(xiàn)，NP-KLH抗原免疫后傷害性感受器的活性增強，進而誘導脾臟內CGRP的釋放。那么，炎癥介質是否參與了傷害性感受器的激活？他們發(fā)現(xiàn)，抗原免疫導致前列腺素E2（PGE2）在脾臟中積累，且PGE2激活傷害性感受器以釋放CGRP。

接下來，他們評估了神經肽CGRP對脾臟生發(fā)中心反應的影響。在NP-KLH早期免疫過程中注射CGRP會促進生發(fā)中心B細胞和脾臟漿細胞的產生，但在晚期免疫過程中注射則不然，表明CGRP在生發(fā)中心反應的早期階段發(fā)揮重要作用。此外，對切除背根神經節(jié)-脾臟神經連接的小鼠，脾臟內CGRP的水平顯著下降，但注射CGRP能挽救小鼠的生發(fā)中心反應缺陷和NP特異性抗體水平。從這些結果可以看出，來源于背根神經節(jié)傷害性感受器的神經肽CGRP負責了脾臟生發(fā)中心反應和體液免疫。

在探究背后機制時，研究人員發(fā)現(xiàn)B細胞高水平表達CGRP的異源二聚體受體，特別是Calcrl和Ramp1。為此，他們將Calcrl^fl/fl小鼠（由賽業(yè)生物提供）與Cd19-Cre小鼠雜交，構建出Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠，對B細胞中的Calcrl進行條件性敲除。在NP-KLH免疫后，Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠的體液免疫反應顯著減少。更重要的是，CGRP對脾臟生發(fā)中心反應的促進作用消失了（圖2）。在感染流感病毒PR8后，Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠體重減輕，且死亡率明顯增加。由此可見，B細胞上的CALCRL對于抗病毒感染的生發(fā)中心反應和體液免疫至關重要。

為了進一步驗證CGRP受體的作用，他們利用Ramp1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）和B細胞缺陷型（μMT）小鼠構建骨髓嵌合體小鼠，這些小鼠的所有B細胞都缺乏Ramp1。在NP-KLH免疫后，Ramp1^-/-小鼠在生發(fā)中心反應和體液免疫方面存在明顯的缺陷。他們還發(fā)現(xiàn)，CGRP刺激誘導了B細胞中cAMP的積累。利用腺苷酸環(huán)化酶（AC）激動劑處理Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠（以刺激cAMP產生）后，這些小鼠受損的生發(fā)中心反應得以恢復（圖2）。這些結果表明，CGRP通過B細胞上的異源二聚體受體CALCRL-RAMP1激活cAMP信號通路，最終促進脾臟生發(fā)中心反應。
 

圖2 B細胞上的CGRP受體CALCRL-RAMP1促進了生發(fā)中心反應^[1]

4. 辣椒素激活傷害性感受器可增強抗流感免疫力
考慮到傷害性感受器在生發(fā)中心反應中的作用，研究人員假設攝入辛辣食物（含有辣椒素）來激活傷害性感覺神經有可能增強體液免疫。與假設一致，在喂食含辣椒素的飲食后，NP-KLH免疫小鼠的體液免疫反應顯著增強。在切斷左側T8-T13背根神經節(jié)的傷害性感受器后，辣椒素對脾臟生發(fā)中心反應的增強效應被阻斷。用辣椒素喂養(yǎng)的小鼠在感染流感病毒PR8后，病毒載量和肺部免疫細胞浸潤明顯減少；且辣椒素能夠有效防止小鼠體重下降，并顯著提高小鼠的存活率。這些結果表明，攝入辣椒素能夠增強病毒抗原誘導的體液免疫反應，并提高宿主對病毒感染的防御能力。

研究結論

圖3 傷害性感覺神經元促進生發(fā)中心反應和體液免疫的示意圖^[1]

這項研究揭示了脾臟內完整的傷害性感覺神經纖維的3D結構，并確定了背根神經節(jié)-脾臟神經連接在體液免疫中的關鍵作用。從機制上講，傷害性感受器產生的CGRP可通過B細胞上的異源二聚體受體CALCRL-RAMP1激活cAMP信號通路，從而促進生發(fā)中心反應并增強體液免疫（圖3）。

參考文獻：
[1]Wu M, Song G, Li J, et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 2024 May 15: S0092-8674(24)00453-7. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.027

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